Как делать колосок: схемы и пошаговые фото инструкции для начинающих

Маркировка травы
1 2 3 4

Структура травы

Контроль судьбы меристемы колосков кукурузы с помощью APETALA2-подобного гена undeterminate spikelet1

1. Джордж Чак,
2. Роберт Б.Мили и
3. Сара Хейк

1. Департамент биологии растений и микробов, Калифорнийский университет, Беркли, Калифорния 94720, США; Pioneer Hi-Bred International, Джонстон, Айова 50131, США; Центр экспрессии генов растений, Министерство сельского хозяйства и Служба сельскохозяйственных исследований США (USDA-ARS), Олбани, Калифорния 94710, Соединенные Штаты Америки

Абстрактные

Упорядоченное производство меристем с определенной судьбой имеет решающее значение для правильной разработки архитектуры растений.Кукуруза меристема соцветия разветвляется несколько раз, образуя боковые меристемы с определенными судьбами. Образовалась первая меристема, меристема пары колосков дает две меристемы колосков, каждая из которых дает две цветочные меристемы. Мы определили ген, названный undeterminate spikelet1 ( ids1 ), который определяет детерминированную судьбу меристемы колосков и тем самым ограничивает количество продуцируемых цветочных меристем.В отсутствие Из-за функции гена ids1 меристема колосков становится неопределенной и дает дополнительные соцветия. Члены семейства злаковых различаются по количеству цветков в их колосках, предполагая, что ids1 могут играть роль в архитектуре соцветий у других видов трав. ids1 является членом семейства генов транскрипционных факторов APETALA2 ( AP2 ), которые участвуют в широком диапазоне ролей в развитии растений.Выражение ids1 был обнаружен во многих типах зачатков боковых органов, а также в меристемах колосков. Наш анализ мутантного фенотипа ids1 и паттерна экспрессии показывает, что ids1 определяет детерминированные судьбы путем подавления неопределенного роста в меристеме колосков.

Развитие тела растения зависит от активности апикальных меристем, групп неопределенных клеток, обнаруженных на советы по выращиванию.Способность апикальных меристем побегов оставаться неопределенными позволяет им постоянно инициировать органы, ткани и вторичные меристемы, необходимые для нормального развития. Это свойство требует, чтобы меристема выделяла популяцию. клеток, чтобы обновиться и восполнить потери клеток в каждом боковом органе или вторичной меристеме. Провал этого процесса произойти приводит к прекращению роста кончика. Некоторые меристемы, например цветочные меристемы, потребляются при производстве боковых органов и могут быть описаны как имеющие определенную судьбу.Соцветие кукурузы особенно полезно для изучение детерминированности меристемы, поскольку она претерпевает несколько четко определенных событий ветвления, чтобы произвести меристемы со все более ограниченные судьбы.

Соцветия травы организованы в группы, называемые колосками, каждый из которых состоит из пары стерильных прицветников, называемых чешуйками, покрывающими фиксированное количество цветков (Clifford 1987). Регулирование количества цветков на колоске является основным фактором, определяющим архитектуру колосков среди членов травы. семья.Колосок кукурузы является детерминантным, дает только два цветочка в определенных положениях на оси, называемой рахиллой. (Weatherwax 1923). Родственники кукурузы характеризуются колосками с неопределенным количеством цветков, например пшеница, или содержат только по одному цветочку на колоск, как у ячменя. Один из классических критериев, используемых для различения различных видов трав, заключается в том, колоски содержат определенное или неопределенное количество цветков (Clifford and Watson 1977).Сам колоск — лишь один из компонентов сложного разветвленного соцветия кукурузы. В отличие от двудольных у таких растений, как Arabidopsis , у которых цветки образуются непосредственно апикальной и боковой меристемами (Hempel and Feldman 1994), у кукурузы есть по крайней мере две отчетливые стадии ветвления соцветий до того, как меристема колосков завершится в производстве. из двух цветочков. Эти дополнительные ступени ветвления обеспечивают большее морфологическое разнообразие трав.

У кукурузы описан ряд мутантов, которые приводят к появлению дополнительного количества цветков внутри колоска (Veit et al. 1993). У мутантов с разветвленной ветвью без шелка дополнительные соцветия начинаются у мужских колосков кисточки (Kempton 1934), хотя более сильная трансформация наблюдается в женских колосках уха, у которых соцветия превращаются в длинные. индетерминантные ветви (Veit et al. 1993). Исследования мутации Tasselseed6 показали, что меристема колосков задерживается в достижении детерминированности, что позволяет ей запускать соцветия. в течение более длительного периода времени (Irish et al.1994). Анализ мутантов Tasselseed6 привел к модели (Irish 1997), в которой меристема соцветия и ее производные ветви проходят через упорядоченную, определенную серию детерминированных онтогенетических групп. состояний, заканчиваясь превращением терминальной меристемы колосков в верхний цветочек. Подобные ветвящиеся мутанты имеют также были описаны для других видов трав и включают мутацию multiflorous ячменя (Bossinger et al., 1992) и доминирующий мутант Naked овса (Ougham et al.1996).

Множество генетических и молекулярных исследований выявило несколько генов, важных для развития цветков. Один такой ген, гомеотический ген APETALA2 ( AP2 ) Arabidopsis, выполняет несколько функций в развитии цветков, семян и семяпочек (Kunst et al. 1989; Jofuku et al. 1994; Modrusan et al. 1994). Помимо своей роли в определении идентичности цветочных органов, AP2 влияет на регуляцию идентичности цветочной меристемы.Например, двойные мутанты слабого аллеля ap2-1 с мутантами идентичности цветочной меристемы, такими как листовой или apetala1 , производят больше боковых ветвей соцветия вместо цветков (Bowman et al. 1993). Кроме того, слабые аллели ap2 в короткие дни вызывают образование третичных цветочных побегов в пазухах трансформированных чашелистиков (Schultz and Haughn 1993). Ген AP2 принадлежит к большому семейству генов, 12 из которых были идентифицированы у Arabidopsis (Okamuro et al.1997). Многочисленные гомологи были идентифицированы как у однодольных, так и у двудольных (Jofuku et al. 1994; Ohme-Takagi and Shinshi 1995; Moose and Sisco 1997). Мутации в AP2 -подобном гене, AINTEGUMENTA, нарушают развитие яйцеклетки (Elliot et al. 1996; Klucher et al. 1996). Недавно было показано, что ген glossy15 кукурузы является геном, подобным AP2 , который репрессирует признаки взрослых листьев в молодых листьях (Moose and Sisco 1997).

Здесь мы описываем новый мутант ветвления кукурузы, undeterminate spikelet1 ( ids1 ), который мы получили путем анализа фенотипа, обусловленного потерей функции гена, подобного AP2 кукурузы. ids1 мутанты имеют неопределенный колосок, в котором образуется несколько цветков вместо двух, характерных для кукурузы дикого типа. ids1 Экспрессия наблюдалась во множестве боковых органов, а также в паре колосков и меристемах колосков. Наш анализ указывает на то, что ген ids1 является критическим для регуляции детерминированности меристемы колосков кукурузы.

Результаты

Выделение гена

Ген AP2 из Arabidopsis был использован для скрининга двух библиотек кДНК кукурузы с низкой строгостью, одна получена из незрелых початков, а другая из вегетативных. меристемы.Один и тот же класс кДНК был выделен из каждой библиотеки. Самый длинный клон этого класса состоял из 1967 нуклеотидов и содержала ORF из 433 аминокислот (фиг.) с несколькими доменами, демонстрирующими поразительное аминокислотное сходство с геном AP2 из Arabidopsis (Jofuku et al. 1994). Было обнаружено два тандемно повторяющихся мотива из 68 аминокислот, которые имеют 86% аминокислотную идентичность с доменом AP2 белка Arabidopsis AP2. Семейство генов AP2 можно разделить на две группы, обозначенные как EREBP-подобные или AP2-подобные, в зависимости от того, обладают ли они один или два повтора AP2 соответственно (Okamuro et al.1997). Белок IDS1 относится к последнему классу, который включает белки AP2, AINTEGUMENTA, GLOSSY15 и RAP2.7 (рис.) (Jofuku et al. 1994; Klucher et al. 1996; Moose and Sisco 1997; Okamuro et al. 1997). Белки табака ERE-BP, которые имеют только один из этих повторов, связывают ДНК (Ohme-Takagi and Shinshi 1995). Таким образом, по аналогии вполне вероятно, что IDS1 функционирует как фактор транскрипции. В подтверждение этого краткий отрезок основных аминокислоты, которые могут функционировать как домен ядерной локализации, присутствуют в белке IDS между 100 и 110 аминокислотами. (Рис.). Белок AP2 из Arabidopsis содержит богатый серином кислотный домен на аминоконце, который может функционировать как домен активации (Jofuku et al. 1994). Хотя подобный участок находится на аминоконце белка IDS1 в положениях 9–45, этот участок намного меньше и имеет меньше кислотных и сериновых остатков по сравнению с AP2. За пределами домена AP2 наблюдается очень небольшое сходство последовательностей между AP2 и IDS1. Учитывая это открытие, удивительно, что положения шести интронов в домене AP2 сохраняются. между ids1 и AP2 (рис.). Аналогичный результат был получен для гена gl15 кукурузы (Moose and Sisco 1997).

Нуклеотид и выведенная аминокислотная последовательность IDS1. Аминокислотные числа показаны слева от ; нуклеотидов пронумерованы справа . Подчеркнутые аминокислотные последовательности представляют два домена AP2 (Jofuku et al.1994). Серины и кислые аминокислоты на амино-конце обозначены коротким подчеркиванием. Аминокислотные последовательности выделены жирным шрифтом представляют собой основной регион с предполагаемой активностью ядерной локализации. Полужирные нуклеотидные последовательности соответствуют ZAP2-1. праймер, используемый для скрининга ПЦР. (▿) шесть положений интронов между IDS, AP2, и GL15 сохраняются; (▾) другой интрон.

Сравнение между доменами AP2 AP2 -подобных генов.Выведенные аминокислотные последовательности доменов AP2 IDS1 (номер доступа в GenBank AF048900), RAP2.7 (AF003100), GL15 (U41466) и ANT (U40256) сравниваются с AP2 (ATU12546). Область между двумя повторами AP2, то есть линкерная область, начинается с аминокислоты 78 и заканчивается на 102. Для облегчения совмещения были введены зазоры, представленные точками. Аминокислоты, общие для всех пяти белки выделены жирным шрифтом и на согласованной последовательности внизу .

ids1 был картирован в длинном плече первой хромосомы в положении 192 с использованием рекомбинантных инбредных линий (Burr et al. 1988), зондированных неповторяющимся фрагментом ДНК с 3′-конца ids1. Никакие известные морфологические мутанты не были картированы в этой позиции.

Выделение рецессивных

Чтобы выяснить функцию ids1, , мы использовали обратную генетическую стратегию для генерации аллелей с потерей функции. ПЦР использовали на большой популяции растений, несущих Мутатор ( Mu ) транспозонов для поиска вставок в ids1 (Bensen et al.1995; Мили и Бриггс 1995). Праймеры, фланкирующие домен AP2 ids1 в комбинации с праймерами Mu , дали два независимых события вставки на этом скрининге. Секвенирование продуктов ПЦР позволило локализовать вставки. точнее. Как показано на рисунке, вставка Mu в ids1 – mum1 была локализована в пятом консервативном интроне домена AP2 , тогда как вставка ids1 – mum2 была локализована в первом консервативном интроне на расстоянии 6 п.н. акцепторный сайт сплайсинга.Поскольку Mu элементы генерируют дупликацию 9 пар оснований при вставке (Bennetzen et al. 1993), акцепторный сайт сплайсинга также обнаруживается на 5′-конце Mu.

Локализация элементов Mu в ids1 – mum1 и ids1 – mum2. ids1 Последовательности интронов и экзонов показаны нормальным и жирным шрифтом соответственно.Номера интронов и экзонов показаны выше. последовательности ДНК. Подчеркнутые последовательности представляют характерную дупликацию 9 пар оснований, связанную со вставками Mu .

Линии, несущие аллели ids1 – mum1 и ids1 – mum2 , демонстрировали рецессивный цветочный фенотип, который был более серьезным в линиях ids1 – mum2 .Чтобы убедиться, что вставки в ids1 ответственны за цветочный фенотип, мы проанализировали ДНК из 104 растений F2, используя ген ids1 в качестве зонда на гель-блотах ДНК. Косегрегация новых RFLP с цветочным фенотипом наблюдалась для 29 хромосом. содержащий аллель ids1 – mum1 и 91 хромосому, содержащую ids1 – mum2 (данные не показаны). Не было обнаружено рекомбинантов между цветочным фенотипом и ids1 – mum -специфическими полиморфизмами ни для одного из аллелей.

Мы проанализировали фенотипы ids1 – mum растений после обратного скрещивания с A632 и самоопыления. Наиболее устойчивым фенотипом у мутантов ids1 – mum был дефект в колоске. Зрелые колоски кисточки дикого типа содержат два цветочка, каждый из которых состоит из трех тычинок. и две лодикулы, заключенные в прицветники палеи и леммы (рис. B). Палеа отличается от леммы в силу того, что его положение и тот факт, что он двухкилочный с двойной средней жилкой (Clifford and Watson 1977).Колоски кисточек ids1 – mum2 крупнее, чем у кистей дикого типа (Рис. A) из-за наличия дополнительных цветков (Рис. C). Номер Количество цветков колеблется от минимум 3 из ids1 – mum1 растений до 10 из ids1 – mum2 растений. Помимо этих соцветий, между ними обычно можно увидеть тонкую рахиллу, содержащую несколько более мелких соцветий. два самых верхних цветочка (рис. F). Эти более мелкие соцветия, как правило, постепенно уменьшаются, так что оставшиеся кончик рахиллы едва заметен.Более крупные дополнительные соцветия показывают нормальный образец половой дифференциации и имеют правильное количество тычинок и лодикул, окруженных палеей и леммой (рис. C).

Фенотипы у ids1 – mum мужских и женских колосков. ( A ) Колосок с кисточкой нормальный A632 ( слева, ) и ids1 – mum2 колос с кисточкой ( справа ).( B ) Рассеченный нормальный колоск кисточки A632, показывающий боковые органы верхних и нижних соцветий. ( C ) Расщепленный ids1 – mum2 колосок с кисточкой, показывающий четыре цветочка вместо двух. У каждого цветочка по три тычинки, окруженные палеой и леммой, как в A632. ( D ) Ушной колоск нормальный A632 ( слева, ) и ids – mum1 ушной колоск ( правый ). Стрелки указывают на шелк. ( E ) Срединные продольные срезы неоплодотворенного 25-дневного ребенка ids1 – mum2 ушной колосок ( слева, ) и ушного колоска A632 ( справа, ).Черные стрелки указывают на цветочки. Колоски А632 имеют одиночный цветочек с увеличенным нуцеллусом; ids1 – mum2 ушных колосков имеют по крайней мере три цветочка со значительно сниженным развитием боковых органов. ( F ) ids1 – mum2 колосок с удлиненной рахиллой, содержащей два цветочка. Одиночная стрелка указывает на кончик рахиллы. (st) тычинки; (il) внутренняя лемма; (па) палеа; (ol) внешняя лемма; (ig) внутренняя чешуйка; (og) наружная чешуйка; (уф) верхний цветочек; (lf) ниже цветочек; (ra) рахилла; (фл) цветочек.

Колоски самок ids1 – mum также имеют больший размер из-за наличия лишних цветков (рис. D, E). Колоски нормальные женские содержат только один зрелый цветочек из-за аборта нижнего цветочка (Делонг и др., 1993). Развитие вторичных половых признаков у женских цветков включает в себя прерывание тычинок и развитие гинецея, на примере образования длинных шелков, состоящих из двух сросшихся плодолистиков (Randolph 1936). ids1 – mum1 колосков самок часто содержат более одного шелка, расположенных в эктопических положениях (Рис. D). Эти шелка, однако, обычно не развиваются нормально; они часто не сплавляются и не удлиняются до нужной длины. Если проявляющееся ухо вручную После вскрытия и опыления развиваются несколько зерен, что позволяет предположить, что все другие аспекты оплодотворения и развития плодов нормальный. Достигнув зрелости, эти ядра демонстрируют ids1 – mum гомозиготных фенотипов, и поэтому не представляют собой изъятия из зародыша элементов Mu .Аллель ids1 – mum2 кажется более серьезным, поскольку большинство лишних цветков не могут развить полностью сформированные боковые органы (Рис. E, слева). Приблизительно 5% из ids1 – mum2 женских колосков имеют удлиненную рахиллу, выходящую из колоска (Рис. F). В таких случаях можно заметить, что рахилла не оканчивается верхним цветком, что еще раз подтверждает ее неопределенный характер. Нет очевидного и последовательного фенотипы наблюдались в листьях и корнях ids1 мутантов, несмотря на то, что ids1 экспрессируется в этих органах.

Анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии

Сканирующая электронная микроскопия была использована для определения точки, в которой развитие меристемы колосков ids1 – mum отличается от такового у дикого типа. Меристема соцветия обычно инициирует пару колосков. меристемы акропетально, которые, в свою очередь, разветвляются, образуя две колосковые меристемы (рис.А) (Ченг и др., 1983). Меристемы колосков также разветвляются, образуя нижние и верхние соцветия. Эти цветочки образуют необычный узор, то есть, чередуя 180 градусов друг от друга (Рис. B). Хотя нижняя цветочная меристема инициирует сначала, боковой орган В верхнем цветке развитие происходит значительно раньше, чем в нижнем (рис. C, D). Палеа — первый боковой орган чтобы дифференцироваться, и вскоре после этого развиваются три тычинки (Cheng et al.1983). Половая дифференциация происходит на более поздних стадиях, когда гинецей прерывается у мужских цветков, а тычинки — у самок. цветочки (Dellaporta, Calderon-Urrea, 1993).

Сканирующая электронная микроскопия нормальных и ids1 – mum2 ушей. ( A ) A632 зачаток уха с инициирующими зачатками пары колосков и зачатками колосков.Пруток, 300 мкм. ( B ) A632 меристема неразветвленных колосков ( верхняя ) и несколько более старая ветвистая меристема колосков ( нижняя ). Более старая меристема колосков подвергается боковому ветвлению, инициируя нижний цветочек. Бар, 102 мкм. ( C ) Развитие боковых органов у ушных колосков A632. В первую очередь развиваются боковые органы верхнего цветочка. Пруток, 80 мкм. ( D ) Созревающие боковые органы верхнего цветочка ушных колосков А632 с инициирующим гинецальным гребнем.Штанга, 104 мкм. ( E ) Ветвление ids1 – mum2 меристем колосков. Самая верхняя меристема колосков еще не разветвлена ​​и выглядит удлиненной. Одновременное ветвление цветков зарождение леммы происходит на противоположных сторонах средней и нижней меристем колосков. Штанга, 156 мкм. ( F ) Дальнейшее развитие ids1 – mum2 меристем колосков с удаленными чешуйками, что свидетельствует о развитии цветочных меристем в пазухах чешуек. Колоск меристема сохраняется после каждого события ветвления.Пруток, 58 мкм. ( G ) Более старые ids1 – mum2 меристема колосков с удаленной чешуей. Остаточная меристема колосков удлиняется, образуя новый цветочек. Пруток, 60 мкм. ( H ) ids1 – mum2 колоск, показывающий созревающие боковые органы. Нет различия между верхним и нижним цветочками с точки зрения бокового органа. разработка. Самый молодой цветочек, отходящий от меристемы колосков, не виден леммой. Бар, 171 мкм. (spm) Колоск парная меристема; (см) меристема колосков; (lfm) нижняя цветочная меристема; (gy) гинецей; (fm) цветочная меристема; (ле) лемма.

ids1-mum мутанты показывают нормальное развитие до стадии, на которой меристема колосков начинает ветвиться. На этом этапе меристемы колосков ids1 – mum кажутся слегка удлиненными (Рис. E, вверху). В несколько более старых меристемах колосков (рис. E, в середине) два отчетливых события ветвления можно увидеть по наличию двух лемм (стрелок).Затем в пазухах этих пазух образуются цветочные меристемы. леммы (рис. E, внизу и F). Эти события ветвления происходят на противоположных сторонах меристемы колосков по двоякой схеме. Меристема колосков сохраняется после каждого события ветвления и остается между двумя последними сформированными цветочками (рис. G, H). Этот остаточная меристема колосков продолжает дистично инициировать дополнительные леммы и соцветия (рис. F, G). Скорость бокового органа Развитие между первыми двумя ids1 – mum соцветиями аналогично (рис.H), в отличие от дикого типа, у которого первыми развиваются органы верхнего цветочка.

Мы использовали ген гомеобокса кукурузы узлов, ( kn1 ), который экспрессируется в меристемах, а не в детерминированных боковых органах, для отслеживания событий ветвления. в ids1 – мама колосков. kn1 экспрессируется в меристемах колосков и цветков кукурузы (рис. A, B) (Jackson et al. 1994).Гибридизация с антисмысловым зондом kn1 на ids1 – mum2 меристем колосков показала нормальную экспрессию в меристеме колосков (Рис.C). Однако, как только меристема колосков ids1 – mum2 разветвляется с образованием цветков, меристема колосков становится больше, и, следовательно, домен экспрессии kn1 расширяется (Рис. D). Сильная экспрессия kn1 наблюдается внутри дополнительных цветков, начинающихся от меристемы колосков на более поздних стадиях (рис.E, стрелки) подтверждая меристематическое происхождение дополнительных цветков. Все другие аспекты экспрессии kn1 внутри цветков, включая отсутствие в боковых органах и слое L1, кажутся нормальными.

Локализация in situ kn1 в меристемах колосков A632 и ids1 – mum2 .( A ) Экспрессия kn1 внутри неразветвленной меристемы колоска A632. Пруток, 50 мкм. ( B ) Экспрессия kn1 внутри ветвящейся меристемы колоска A632. Выражение можно увидеть в зарождающемся нижнем цветочке. Пруток, 50 мкм. ( C ) Экспрессия kn1 в неразветвленной меристеме колосков ids1 – mum2 . Пруток, 50 мкм. ( D ) Экспрессия kn1 в пределах раннего ветвления ids1 – mum2 меристемы колосков.По обе стороны от меристемы колосков видны зарождающиеся соцветия. Пруток, 60 мкм. ( E ) Экспрессия kn1 в более старом колоске ids1 – mum2 . Внутри развивающихся соцветий сохраняется сильное выражение. Пруток, 80 мкм. Стрелки указывают на зарождающиеся соцветия. B, D, и E.

Анализ выражения

Первоначальная характеристика экспрессии ids1 с использованием гель-блоттинга РНК показала, что ген экспрессируется как в вегетативных, так и в цветочных тканях.РНК-гель блоттинг с 3′-частью кДНК ids1 показывает, что транскрипт ids1 присутствует во всех протестированных тканях (рис. A). Наименьшее количество экспрессии наблюдалось в ткани эмбриона, а наибольшее в ткани соцветия.

Анализ экспрессии ids1 в различных органах кукурузы B73.( A ) РНК-гель-блот, содержащий 1 мкг поли (A) ⁺ РНК, выделенную из эмбрионов через 17 дней после опыления ( E ), меристемы побегов, включая нерасширенный стебель и самые молодые зачатки листьев ( M ), примордии соцветий длиной до 2 см ( I ), первичные корни семян, проросших во влажном воздухе ( R ), и лопаточная часть полностью распустившихся молодых листьев ( L ) были промоканы и гибридизированы с 3 ‘частью. из кДНК ids1 , которая не включает домен AP2.( B ) Контрольная гибридизация. Блот в A зондировали кДНК убиквитина кукурузы, чтобы показать относительную нагрузку.

Для определения уровней транскрипта ids1 в мутантах ids1 – mum , поли (A) ⁺ РНК была выделена из мутантных ушей и сравнена с РНК из ушей дикого типа. Как показано на рисунке А, транскрипт размера дикого типа отсутствует. был обнаружен в аллеле ids1 – mum .Вместо этого наблюдались слабые транскрипты с более высокой молекулярной массой, которые могут быть результатом химерного или альтернативного склеенные транскрипты. Этот результат демонстрирует, что вставки элементов Mu в ids1 не сплайсируются, и что оба ids1 – mum1 и ids1 – mum2 могут представлять аллели с потерей функции.

Анализ экспрессии ids1 в ids1 – мутантных ушах .( A ) РНК-гель, содержащий 1 мкг поли (A) ⁺ РНК, выделенную из 2-сантиметровых ушей из A632 ( 1 ), ids1 – mum2 ( 2 ) и ids1 – mum1 ( 3 ) подвергали блоттингу и гибридизовали с 3′-частью кДНК ids1 . ( B ) Контрольная гибридизация. Блот в A зондировали кДНК убиквитина кукурузы, чтобы показать относительную нагрузку.

Для более точной локализации временного и пространственного паттерна экспрессии ids1 мы использовали гибридизацию in situ.На рисунке А показаны продольные срезы вегетативного побега дикого типа. apex зондировали меченной дигоксигенином антисмысловой РНК, полученной с 3′-конца клона ids1 . Положение листьев в побеге кукурузы было описано с помощью индекса пластохрона (Lamoreaux et al. 1978), в котором самый молодой лист обозначен как пластохрон 1 или P ₁ , а последующие листья — как P ₂ , P ₃ и т. Д. Положение зарождающегося листа в меристеме обозначается как P ₀ . ids1 Экспрессия обнаруживается на флангах меристемы в дискретной зоне (рис. A). С позиции самого молодого листа (обозначено как P ₁ ), мы предполагаем, что эта зона экспрессии меристемы находится в положении, в котором будет инициироваться следующий лист (обозначенный как P ₀ ). Выражение также видно на кончиках следующих двух старых листьев, P ₁ и P ₂ .

Локализация in situ в вегетативных и цветочных верхушках B73 с использованием 3′-части кДНК ids1 .( A ) Апикальная меристема побега с молодыми зачатками листьев (P ₁ и P ₂ ) и зарождающимися зачатками листьев (P ₀ ). Пруток, 65 мкм. ( B ) Молодое колосовое соцветие. ids1 Экспрессия может быть замечена в акропетально инициирующих зачатках пары колосков. Пруток, 70 мкм. ( C ) Колосковые неразветвленные меристемы. Выражение можно увидеть в меристеме колосков, но не в чешуях. Пруток, 36 мкм. ( D ) Ветвистые колосковые меристемы. Сильное выражение можно увидеть во внутренней и внешней леммах, а также в зоне между инициирующие верхние и нижние соцветия (стрелка без надписи).Эта зона экспрессии постепенно исчезает в более старом колоске. ниже. В инициирующих цветочных меристемах экспрессии не обнаружено. Пруток, 70 мкм. ( E ) Цветочек верхний с зарождающимися тычинками. Дискретные области экспрессии ids1 могут наблюдаться в инициирующих зачатках тычинок и палеа. ids1 выражения сохраняется в расширяющих внутренних и внешних леммах. Пруток, 70 мкм. ( F ) Более старый цветочек с лодикулами. Выражение тычинок теперь локализуется в камерах локул пыльника.Никакого выражения не может быть замечено в лодикулах (ло). Пруток, 70 мкм. ( G ) ids1 – mum2 колоск, исследованный с ids1. Мало или нет ids1 Расшифровка не может быть обнаружена. Стрелки указывают на соцветия. Пруток, 130 мкм.

В продольных срезах ткани цветков экспрессия ids1 обнаруживается в нескольких различных зачатках боковых органов, а также в паре колосков и меристемах колосков.На рисунке B продольные срезы меристем ранних соцветий, исследованные с помощью ids1 , показывают полосы экспрессии в повторяющемся паттерне, который, очевидно, соответствует зачаткам пары колосков. На более позднем этапе после образования ножек и сидячих колосков экспрессия ids1 обнаруживается по всей меристеме колосков, но не в первых двух зачатках боковых органов, образованных из колоска. меристема, внешняя и внутренняя чешуйки (рис.C). Вскоре после зарождения цветочных меристем (рис. D) экспрессия ids1 присутствует в инициирующих внутренних и внешних листьях прицветника леммы, прилегающих к цветкам, но отсутствует в Сама цветочная меристема. Кроме того, видна сильная полоса экспрессии в области между верхними и нижними цветочками. (Рис. D, стрелка без надписи). У немного более старых колосков, как показано в нижней части рисунка D, эта полоса экспрессии начинается исчезнуть.Микрофотография колосков на эквивалентных стадиях, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. соцветия (Рис. E), дискретные группы клеток меристемы цветков, которые образуют тычинки, а палеа экспрессирует ids1. Экспрессия сохраняется на более поздних стадиях в более старых расширенных палеа и лемма, а также в камерах локул пыльника (рис. F). В жёлтях или гинеце уха экспрессия была незначительной или отсутствовала (рис.F; данные не показаны). Как показано на рисунке G, когда зонд anti-sense ids1 используется на ids1 – mum колосках, экспрессия ids1 не обнаруживается.

Обсуждение

Регулирование количества цветков, инициированных меристемой колосков, является важным шагом в определении морфологии колосков.Мутации в гене ids1 влияют на детерминированность меристемы колосков. Вместо того, чтобы давать только верхний и нижний соцветия, меристема колосков ids1 – mum продолжает инициировать дополнительные соцветия в дистихической филлотаксии. Чтобы понять, как ids1 способствует определению меристемы колосков, необходимо изучить различные модели инициации цветков кукурузы.

Одна модель зарождения цветков предполагает, что нижний цветочек начинается латерально, тогда как верхний цветочек — терминальный, в результате превращения меристемы колосков в верхний цветочек (рис.A) (ирландский язык, 1997 г.). У некоторых видов трав, таких как anthoxanthum, , колоск заканчивается цветком, а семяпочка является конечной структурой (Clifford 1987). Если верхний цветочек является терминальной структурой в нормальном развитии кукурузы, белок IDS1 может действовать, способствуя трансформации. меристемы колосков в верхний цветочек. IDS1 может делать это самостоятельно или посредством активации идентичности цветочной меристемы. гены, такие как ортологи LEAFY и APETELA1 , которые могут преобразовывать меристемы соцветий в цветочные меристемы (Mandel and Yanofsky 1995; Weigel and Nilsson 1995).Если бы это было так, мы бы предположили, что трансформация меристемы колосков в меристему цветков задерживается у мутантов ids1 – mum , позволяя меристеме колосков сохраняться и инициировать больше цветков. Такое толкование использовалось объясняют фенотип доминантных мутантов кукурузы Ts6 , у которых образуются лишние соцветия (Irish 1997). Мутанты Ts6 отличаются от мутантов ids1 – mum , однако, тем, что они также влияют на определение пола и вызывают отсутствие подавления карпеля внутри кисточки, но не в ухо.

Модели для инициации цветков кукурузы. ( A ) Конечная модель верхнего цветочка. Колосковая меристема разветвляется один раз латерально, образуя нижний цветочек. Остаточный колоск меристема (показанная черным) затем трансформируется в верхний цветочек (черный). ( B ) Модель бокового разветвления.Меристема колосков имеет боковое ветвление, образуя нижние, а затем верхние соцветия. В остаточная меристема колосков (показана черным) находится в небольшой области между цветками. Зачаток колоска меристема находится в рахилле в зрелом колоске (черный).

Альтернативная модель предполагает, что и верхние, и нижние соцветия являются латеральными продуктами меристемы колосков.Два соцветия кукурузы интерпретируются как боковые ветви рахиллы с небольшим остатком оси или без остатка оси между ними цветочки (Bonnett 1953). Если ветвление верхнего цветочка латеральное, то в рахилле может быть обнаружен сильно редуцированный зачаток меристемы колосков. после зарождения верхнего цветочка (рис. Б). Согласно этой модели IDS1 будет участвовать в подавлении неопределенного роста. внутри меристемы колосков, что препятствует регенерации меристемы колосков после ветвления верхнего цветочка.У мутантов ids – mum остаточная меристема колосков размножается и продолжает образовывать соцветия.

На основании паттерна экспрессии ids1 и времени появления дефектов ids1 – mum , мы отдаем предпочтение второй модели и предполагаем, что функция IDS1 подавляет неопределенный рост в колоске. меристема. Согласно первой модели, переключение судьбы меристемы колосков происходит только после инициирования нижнего цветочка.Однако дефекты в меристемах колосков ids1 – mum были впервые обнаружены в меристеме колосков до зарождения нижних цветков (Рис. E). Сроки дефект указывает на то, что изменение в детерминации судьбы происходит раньше, в соответствии с экспрессией ids1 , наблюдаемой в меристеме колосков до того, как происходит ветвление цветков (Fig. C). Первая модель также предполагает, что вся меристема колосков превращается в верхний цветочек, не оставляя остаточной меристемы колосков.Тем не менее, экспрессия ids1 была обнаружена в зоне между верхними и нижними соцветиями у дикого типа (рис. D), в которой остаточный колоск ожидается, что меристема будет локализована. Дополнительное свидетельство того, что эта область представляет собой остаточную меристему колосков, появляется. из наблюдения, что он регенерирует после ветвления цветков у мутантов ids1 – mum (рис. F, G). Более того, ожидание от первой модели состоит в том, что ids1 будет выражено во всем будущем верхнем цветке, чтобы способствовать его преобразованию в цветочную идентичность.Вместо этого, как показано на рисунке D мы не видим экспрессии ids1 ни в верхней, ни в нижней цветочной меристеме. Наконец, если детерминированность меристемы колосков просто отложено у мутантов ids1 – mum в соответствии с первой моделью, можно было бы ожидать, что рахилла в конечном итоге оканчивается цветком. Это было не наблюдается ни у самцов, ни у ids1 – mum колосков (рис. F; данные не показаны).

Считается, что развитие критического размера меристемы у кукурузы дает сигнал к возникновению ветвления (Sundberg and Orr 1996). Одним из механизмов, с помощью которого IDS1 может подавлять неопределенный рост, является ограничение размера остаточной меристемы колосков. такой, что он больше не может начинать соцветия. У мутантов ids1 – mum размер остаточной меристемы колосков может быть нарушен и увеличиваться до большего, чем обычно.Колоск большего размера меристема потенциально может позволить большему количеству событий ветвления произвести дополнительные соцветия. В поддержку этой идеи ids1 – mum меристема колосков кажется более удлиненной, чем обычно, до образования цветков (Рис. E). Также более крупная меристема колосков диаметр наблюдается вскоре после зарождения первого цветочка у мутантов ids1 – mum (рис. D).

Однако важно понимать, что судьба меристемы не всегда зависит от размера меристемы.Например, верхняя Цветочная меристема намного больше, чем нижняя цветочная меристема во время инициации (Рис. B), и тем не менее обе они одинаково решил сделать цветочки. Таким образом, наличие более крупной меристемы колосков не обязательно наделяет ее большей неопределенностью. Не менее важным компонентом различия между определенными и неопределенными судьбами меристемы колосков является способность регенерировать после зарождения цветков.Меристемы с неопределенной судьбой могут проявлять большую способность к самовосстановлению. независимо от их первоначального размера. Измененная морфология, наблюдаемая в меристемах колосков у мутантов ids1 – mum , может быть просто отражением этой способности.

Возможно, что одним из способов, которым IDS1 функционирует для поддержания детерминированности меристемы колосков, является подавление этих необходимых факторов. для сохранения неопределенности.Ген гомеобокса kn1 экспрессируется в нескольких типах неопределенных меристематических тканей, но не в определенных органах, таких как листья. (Смит и др., 1992; Джексон и др., 1994). Мутанты с потерей функции kn1 кукурузы демонстрируют пониженное ветвление метелки и меньшее количество колосков. Постулировалось, что этот фенотип является результатом потери неопределенного клетки соцветия, которые, в отсутствие kn1, приняли определенную судьбу (Kerstetter et al.1997). Если kn1 на самом деле поддерживает неопределенность меристемы, то экспрессия kn1 должна сохраняться в пределах меристемы колосков ids1 – mum и демонстрировать расширенный домен. Хотя это наблюдалось (Fig. D), важно отметить, что kn1 обычно экспрессируется как в колосковых, так и в цветочных меристемах (Fig. A, B). Таким образом, тот факт, что домен экспрессии kn1 расширяется у мутантов ids1 – mum , может просто отражать дополнительные области инициации цветков.

Ген ids1 был клонирован по гомологии с геном AP2 Arabidopsis , и было показано, что он содержит два повтора высококонсервативного домена AP2. Хотя белок IDS1 показывает большее сходство с AP2 по сравнению со всеми другими AP2 -подобными генами, клонированными до сих пор, ген ids1 может не представлять фактический ортолог AP2 кукурузы.Гомология аминокислот между IDS1 и AP2 не распространяется за пределы домена AP2. Кроме того, Экспрессия ids1 не была обнаружена в плодолистых, как обнаружено для AP2 (Jofuku et al. 1994). Наконец, предварительные эксперименты показывают, что сверхэкспрессия кДНК ids1 в Arabidopsis не дополняет мутантный фенотип ap2-1 (G. Chuck unpubl.). Дополнительные члены семейства AP2 , вероятно, будут присутствовать в геноме кукурузы, потому что гибридизации с низкой строгостью с доменом ids1 AP2 в качестве зонда на саузерн-блотах кукурузы показывают несколько полос гибридизации (данные не показаны).Кроме того, несколько выраженных Было показано, что теги последовательностей из библиотек кДНК кукурузы содержат домены AP2 (Klucher et al. 1996).

Несмотря на то, что ids1 экспрессируется в зачатках вегетативных и цветочных боковых органов, явных мутантных фенотипов в этих органах обнаружено не было. В этих органах может действовать определенный уровень генетической избыточности, который может быть обнаружен только путем анализа двойного мутанты.Например, двойные мутанты ap2 и aintegumenta обнаруживают фенотипы цветочных органов, не наблюдаемые ни у одного из одиночных мутантов Arabidopsis (Elliot et al. 1996). Учитывая большое количество AP2 -подобных генов, присутствующих в геноме Arabidopsis (Okamuro et al. 1997), было бы неудивительно обнаружить такую ​​функциональную избыточность, имеющую место у кукурузы. Недавно было высказано предположение, что два тесно связанных гена MADS-бокса, zag1 и zmm2, , играют избыточную роль в определении идентичности плодолистиков и тычинок кукурузы (Mena et al.1996).

Хотя органы цветков ids1 – mum соцветий кисточки полностью функциональны и напоминают органы цветков дикого типа, дефекты органов цветков наблюдались у ids1 – mum женских колосков. Возможное объяснение этого дефекта может заключаться в том, что у нормальной самки происходит выкидыш нижнего цветочка. колоски. Если различие между верхними и нижними цветками утрачено у мутантов ids1 – mum , то все цветочки могут получить сигнал об прерывании беременности, который обычно присутствует только в нижних цветках дикого типа.Для проверки этой модели будет полезен анализ двойных мутантов с мутантом tasseled 2 , у которого не происходит выкидыша нижних цветков (DeLong et al. 1993).

В свете того факта, что многие представители семейства злаковых обладают неопределенными колосками, есть соблазн предположить, что AP2 -подобных генов играют роль в регуляции количества цветков у других трав. Колоски с множеством цветков считаются древним признак, учитывая, что производные виды почти повсеместно эволюционировали, уменьшив количество цветков (Стеббинс, 1987).Возможный механизм такого снижения может включать изменение функции или домена экспрессии гена ids1 с включением меристемы колосков в дополнение к различным латеральным органам, где он обычно экспрессируется. Анализ В этом отношении будет интересно проанализировать экспрессию ids1 как в современных, так и в древних травах.

Материалы и методы

Клонирование гена

Сорок тысяч бляшек библиотеки кДНК B73, построенных из ушей соцветий размером от 1 до 3 см (Jackson et al.1994) были исследованы при пониженной строгости при 55 ° C в 50% формамиде (Schmidt et al. 1993) с полноразмерной кДНК AP2 из Arabidopsis (Jofuku et al. 1994). Было выделено примерно 75 положительных клонов. Далее был проанализирован только самый сильный гибридизирующий класс. Представитель клон из этого класса был использован для исследования библиотеки кДНК вегетативной меристемы B73 (Lambda ZapII, Stratagene), из которой полноразмерный Была выделена кДНК размером 1,9 т.п.н. КДНК была субклонирована в pSK- и обе цепи секвенировали с помощью секвенатора ABI.Анализ последовательности было сделано с использованием GCG (Wisconsin Genetics Group) и сервера E-MAIL Национального центра биотехнологии.

Гель-блоты РНК и гибридизация in situ

выделяли из зародышей, ушей, вегетативных меристем и корней, как описано ранее (Kerstetter et al. 1994). Гибридизацию in situ проводили, как описано Jackson et al.(1994) с использованием 3′-концевого зонда между нуклеотидами 1330 и 1835 вне консервативного домена AP2 . Этот же фрагмент ДНК использовали для зондирования всех гель-блотов РНК. Наблюдается единственная полоса, гибридизирующаяся с этим зондом. на ДНК-гель-блотах (данные не показаны), поэтому перекрестная гибридизация с другими членами семейства AP2 маловероятна.

Выделение рецессивных аллелей

Приблизительно 42000 F ₁ растений от скрещиваний между запасами, содержащими активные мобильные элементы Mu , выращивали и проверяли с помощью ПЦР Pioneer Hi-Bred International для вставки в ID1 (Bensen et al.1995) с праймером ZAP2-1 (5′-CCGGTGGCGCCAGCGAAGAA-3 ‘) и Mu-9242 (5′-CCCTGAGCTCTTCGTC (CT) ATAATGGCAATTATCTC-3’), вырожденный праймер, который связывается с концевым инвертированным повтором Mu. реакций ПЦР проводили на гелях, блотировали и зондировали с помощью кДНК ids1 . Продукты ПЦР, которые гибридизуются с кДНК ids1 , идентифицировали людей, которые, вероятно, имеют вставки Mu в ген ids1 . Такой скрининг идентифицировал девять кандидатов с использованием праймера ZAP2-1.ДНК-гель-блот-анализ расщепленной ДНК, полученной из самоопыляемое потомство каждого кандидата выявило полиморфизм только для двух из девяти семейств при зондировании с помощью кДНК ids1 . Эти же два семейства были единственными, которые генерировали продукты ПЦР ids1 с использованием праймеров ZAP2-1 и Mu 9242. Вероятно, что семь других семейств, которые не показали полиморфизмов представляют собой события соматической вставки Mu в ids1 , которые не передаются в зародышевую линию.Каждый аллель ids1 – mum был получен от скрещивания активной линии Mu и инбредной линии A632. Оба аллеля были однократно скрещены с A632 и подверглись самоопылению для наблюдения фенотипов. у гомозигот. Фенотипы также наблюдались после второго обратного скрещивания с A632 и обратного скрещивания с инбредным W23.

Сканирующая электронная микроскопия

Ткань фиксировали в FAA (50% этанол, 5% уксусная кислота, 3.7% формальдегида) при 4 ° C в течение ночи и обезвоживание в этаноле серию до 100%. Затем образцы были высушены до критической точки и напылены палладием. Образцы были просмотрены на ISI 30 РЭМ при ускоряющем напряжении 10 кВ.

Благодарности

Мы благодарим Дж. Окамуро и Д.Джофуку (Калифорнийский университет, Санта-Крус) за дар кДНК AP2 , Р. Керстеттеру за использование его РНК-блоттинга и К. Канаде (Pioneer Hi-Bred International) за идентификацию вставок ids1 . Мы также признательны Э. Фольбрехту, П. Макстину, Л. Рейзеру, Ф. Хемпелю и сотрудникам лаборатории Хека. за рецензирование рукописи и полезные обсуждения. G.C. был поддержан стипендией Калифорнийского университета. Работа поддержана Институтом У.S. Департамента сельского хозяйства и частично выполняются в рамках Совместных исследований и разработок. Соглашение с Pioneer Hi-Bred International, Inc.

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому эта статья должна быть настоящим помечены как «реклама» в соответствии с разделом 1734 Кодекса США 18 исключительно для обозначения этого факта.

Морфология колосков шести родов Oryzeae в JSTOR

Колоски шести родов Oryzeae, обнаруженные в Соединенных Штатах, исследуются на предмет идентичности прицветников, непосредственно окружающих цветок.Внутренний из этих прицветников был ответственен за различные интерпретации колоска. Он находится в положении палеа, но имеет от трех до семи сосудистых пучков у разных видов, в то время как два считаются нормальным количеством нервов для палеа. Однако свидетельствам, выводимым из положения частей двусторонне-симметричного цветка, придается больший вес, чем количеству нервов в прицветнике, и структура рассматривается как палеа. Эта интерпретация позволяет нам свести все рассматриваемые здесь колоски к единому структурному плану, в котором цветок окружен леммой и палеей, чешуйки присутствуют у Oryza, рудиментарные у Zizania и отсутствуют у Leersia, Zizaniopsis и Hydrochloa.Состояние чешуек у Luziola не определено.

Издается Ботаническим обществом Америки непрерывно с 1914 года. Американский журнал ботаники (AJB) является ведущим исследовательским журналом Общества. AJB публикует рецензируемые, инновационные, важные исследования, представляющие интерес для широкой аудитории ученых во всех областях биологии растений (например, биоразнообразие, структура, функции, развитие, генетика, эволюция, воспроизводство, систематика), всех уровнях организации (молекулярная экосистемы), а также все группы растений и родственные им организмы (цианобактерии, водоросли, грибы и лишайники).

Wiley — глобальный поставщик контента и решений для рабочих процессов с поддержкой контента в областях научных, технических, медицинских и научных исследований; профессиональное развитие; и образование. Наши основные направления деятельности выпускают научные, технические, медицинские и научные журналы, справочники, книги, услуги баз данных и рекламу; профессиональные книги, продукты по подписке, услуги по сертификации и обучению и онлайн-приложения; образовательный контент и услуги, включая интегрированные онлайн-ресурсы для преподавания и обучения для студентов и аспирантов, а также для учащихся на протяжении всей жизни.Основанная в 1807 году компания John Wiley & Sons, Inc. уже более 200 лет является ценным источником информации и понимания, помогая людям во всем мире удовлетворять их потребности и реализовывать их чаяния. Wiley опубликовал работы более 450 лауреатов Нобелевской премии во всех категориях: литература, экономика, физиология и медицина, физика, химия и мир. Wiley поддерживает партнерские отношения со многими ведущими мировыми обществами и ежегодно издает более 1500 рецензируемых журналов и более 1500 новых книг в печатном виде и в Интернете, а также базы данных, основные справочные материалы и лабораторные протоколы по предметам STMS.Благодаря расширению предложения открытого доступа, Wiley стремится к максимально широкому распространению и доступу к публикуемому контенту, а также поддерживает все устойчивые модели доступа. Наша онлайн-платформа, Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com), является одной из самых обширных в мире междисциплинарных коллекций онлайн-ресурсов, охватывающих жизнь, здоровье, социальные и физические науки и гуманитарные науки.

Семейства цветущих растений, UH Botany

супрессор сидячих колосков1 Функции пути рамозы, контролирующие детерминацию меристем у кукурузы

• © 2009 Американское общество биологов растений

Реферат

Колосок, представляющий собой короткую ветвь, несущую соцветия, является фундаментальной единицей архитектуры соцветий травы. У большинства трав колоски поодиночке расположены на соцветиях.Однако парные колоски характерны для Andropogoneae, трибы из 1000 видов, включая кукурузу ( Zea mays ). Подавитель сидячих колосков1 ( Sos1 ) мутант кукурузы дает одиночные, а не парные колоски в соцветии. Следовательно, ген sos1 мог участвовать в эволюции парных колосков. В этой статье мы показываем, что Sos1 является полудоминантной антиморфной мутацией. Sos1 Мутанты имеют меньше ветвей и колосков по двум причинам: (1) образуется меньше меристем пар колосков из-за дефектов размера меристемы соцветий и (2) образующиеся меристемы пары колосков образуют одну вместо двух меристем колосков.Было исследовано взаимодействие Sos1 с мутантами ramosa , которые производят больше ветвей и колосков. Результаты показывают, что Sos1 имеет эпистатическое взаимодействие с ramosa1 ( ra1 ), синергетическое взаимодействие с ra2 и аддитивное взаимодействие с ra3 . Более того, уровни мРНК ra1 и снижены у мутантов Sos1 , в то время как уровни мРНК ra2 и ra3 остаются неизменными.Основываясь на этих генетических исследованиях и исследованиях экспрессии, мы предполагаем, что sos1 функционирует в ветви ra1 пути ramosa , контролируя детерминированность меристемы.

Органогенез растений контролируется меристемами (Steeves and Sussex, 1989). Органы образуются в периферической зоне меристемы, в то время как в центральной зоне сохраняется пул клеток, которые не дифференцируются, что позволяет меристеме поддерживать себя. Меристемы определяются их определенностью, идентичностью и положением (McSteen et al., 2000). Детерминантные меристемы продуцируют ограниченное количество структур перед окончанием, тогда как неопределенные меристемы обладают потенциалом продолжать продуцировать органы неопределенно долго (Bortiri and Hake, 2007; Sablowski, 2007). Апикальные меристемы у многих видов индетерминантные. Апикальная меристема побега (САМ) дает начало вегетативному побегу, а апикальная меристема соцветия дает начало цветущему побегу. Пазушные меристемы, образующиеся в пазухах зачатков листьев, могут быть неопределенными и давать ветви или могут быть детерминантными и давать начало цветкам.

В развитии соцветий кукурузы ( Zea mays ) существует несколько типов пазушных меристем, которые различаются по своей детерминированности, что приводит к сильно разветвленному соцветию (Irish, 1997a; Bortiri and Hake, 2007; Barazesh and McSteen, 2008b). Созревшее мужское соцветие состоит из главного колоса и нескольких длинных боковых ветвей, которые покрыты короткими ветвями, называемыми парами колосков (рис. 1А; Киссельбах, 1949). Колоск определяется как короткая ветвь с двумя листовидными чешуйками, окружающими соцветия (Clifford, 1987).Во время развития соцветия меристема верхушечного соцветия (IM) производит пазушные меристемы, называемые меристемами ветвей (BM), которые являются неопределенными и производят ветви. После того, как сделано несколько ветвей, IM резко переключается на производство меристем пар колосков (SPM), которые являются детерминированными, поскольку они производят два колоска. Меристемы колосков (SM) также детерминированы, поскольку они производят две цветочные меристемы (FM), которые затем производят цветочные органы. Хотя у кукурузы есть отдельные мужские и женские соцветия, называемые кисточкой и колосом соответственно, раннее развитие похоже, за исключением того, что колосья не дает ветвей.

Sos1 фенотип кисточки и уха. A, фотография зрелых кисточек до цветения. Обычные кисточки имеют длинные ветки у основания главного шипа. Пары колосков покрывают ветви и главный колос. Мутанты Sos1 / + имеют редкий вид из-за образования меньшего количества ветвей и колосков. Sos1 / Sos1 мутанты имеют очень мало ветвей и одиночных колосков. B, количественное определение количества веток в кисточке. C. Количественная оценка количества парных (серая полоса) по сравнению с одиночными (белыми) колосками на главном колоске кисточки.D. Фотография зрелых колосьев после открытого опыления. Нормальные уши имеют парные ряды ядер. Уши Sos1 / + и Sos1 / Sos1 имеют меньшее количество рядов ядер в ухе. E, Количественная оценка количества ядер на ухо. F, Количественное определение количества рядов ядер на ухо. Sos1 / Sos1 У ушей меньше половины количества рядов по сравнению с обычными родными братьями. Все графики являются средними ± стандартными значениями. [Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье.]

Были предложены две модели, чтобы объяснить, как SPM производит два SM, а SM производит два FM (Irish, 1997a, 1998; Chuck et al., 1998; Каплинский и Фрилинг, 2003). В модели латерального ветвления SPM продуцирует две SM посредством бокового ветвления, а остаточная меристема остается между двумя SM (Chuck et al., 1998). В модели преобразования SPM инициирует SM, а затем оставшийся SPM преобразуется в SM (Irish, 1997a, 1998). Сильную поддержку модели конверсии недавно предоставили эксперименты, в которых нормальные растения кукурузы обрабатывали ингибиторами транспорта ауксина, которые ингибировали инициацию SM, но не ингибировали превращение SPM в SM, что приводило к образованию одиночных колосков (Wu and McSteen , 2007).

Супрессор сидячих колосков ( Sos1 ) мутант производит одиночные, а не парные колоски в соцветии (Doebley et al., 1995). У нормальных растений один колосок прикрепляется к позвоночнику соцветия ножкой и называется колоском на ножке, а другой колоск, не имеющий цветоножки, называется сидячим колоском. У мутантов Sos1 сидячий колоск не образуется, что приводит к образованию единичных колосков на ножке. Следовательно, у мутантов Sos1 SPM продуцирует один SM вместо двух и, следовательно, более детерминирован, чем обычно.

Детерминированность SPM положительно регулируется путем ramosa (McSteen, 2006; Kellogg, 2007). ramosa1 ( ra1 ) кодирует фактор транскрипции цинкового пальца, экспрессируемый в основании SPM (Vollbrecht et al., 2005). У мутантов ra1 кисточка и початок сильно разветвлены, потому что SPM становятся неопределенными и вырастают, давая дополнительные колоски (Gernart, 1912; Vollbrecht et al., 2005). ra1 действует ниже ra2 , который кодирует фактор транскрипции LOB-домена, экспрессируемый в зачатке BM, SPM и SM (Bortiri et al., 2006а). ra1 также действует ниже ra3 , который кодирует трегалозо-6-фосфатфосфатазу (Satoh-Nagasawa et al., 2006). Интересно, что хотя ra2 — и ra3 -подобных генов присутствуют в других злаках, таких как рис ( Oryza sativa ), ra1 был идентифицирован только у Andropogoneae, клады, к которой принадлежит кукуруза.

У подавляющего большинства злаков, включая рис, ячмень ( Hordeum vulgare ) и пшеницу ( Triticum aestivum ), колоски образуются поодиночке (Clifford, 1987).Производство парных колосков характерно для Andropogoneae, трибы из 1000 видов, включая кукурузу, мискантуса , сахарный тростник ( Saccharum officinarum ) и сорго ( Sorghum bicolor ; Kellogg, 2000, 2001; Grass Phylogeny Working Group, 2001). В племени Paniceae, которое является сестрой Andropogoneae, у большинства видов есть одиночные колоски, но некоторые виды производят парные колоски, а другие производят колоски, соединенные с щетинками, которые представляют собой модифицированные колоски (Kellogg, 2000; Doust and Kellogg, 2002). .Следовательно, парный колоск является производным признаком, хотя неясно, когда этот признак возник во время эволюции Panicoideae. Было высказано предположение, что ra1 могло быть задействовано для эволюции признака парных колосков (Vollbrecht et al., 2005; McSteen, 2006). Поскольку мутанты Sos1 производят одиночные, а не парные колоски, ген sos1 также может быть вовлечен в эволюцию парных колосков.

В этой статье мы используем количественный анализ, сканирующую электронную микроскопию (SEM) и гистологию, чтобы показать, что мутация Sos1 вызывает дефекты в развитии IM, BM и SPM как в кисточке, так и в ухе.Мы используем анализ дозировки, чтобы показать, что Sos1 является антиморфом, то есть доминантно-отрицательной мутацией. Более того, генетический анализ и анализ экспрессии предоставляют доказательства того, что ген sos1 действует в ветви ra1 пути ramosa , контролируя детерминированность меристемы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Аллель Sos1-Reference возник спонтанно (Doebley et al., 1995). Семена были получены из кукурузного генетического кооператива и подвергнуты обратному скрещиванию с получением B73.Ранее сообщалось, что мутант отображается на коротком плече хромосомы 4 (Doebley et al., 1995). Для создания картирующей популяции Sos1 (на фоне B73) скрещивали с генетическим фоном Mo17 и скрещивали с Mo17. Маркеры простого повтора последовательности (SSR) использовали для дальнейшего определения местоположения Sos1 с точностью до 4 см umc1294 в ячейке 4.02. Поскольку маркер umc1294 был полиморфен между B73 и исходным фоном, на котором возник Sos1 , этот маркер использовали для генотипирования Sos1 на фоне B73.Генотипирование в сочетании с анализом фенотипа определили, что мутация Sos1 была полудоминантной, а не доминантной, как сообщалось ранее (Рис. 1; Doebley et al., 1995).

Sos1 мутанты имеют дефекты кисточки и уха. В метелке мутантных растений Sos1 давали меньше ветвей и колосков (рис. 1, A – C). Семьи, сегрегированные по Sos1 , были генотипированы, и количество ветвей и колосков было подсчитано у нормальных братьев и сестер по сравнению с растениями, гетерозиготными и гомозиготными по Sos1 .Эти результаты показали, что мутанты Sos1 / + и Sos1 / Sos1 давали меньше ветвей, чем обычно (рис. 1B). Для анализа дефектов колосков отдельно подсчитывали количество парных колосков по сравнению с одиночными. В то время как у нормальных растений были парные колоски, у мутантов Sos1 / + и Sos1 / Sos1 было больше одиночных, чем парных колосков (рис. 1C).

Мутация Sos1 также затронула ухо. Нормальные уши не разветвлены, но дают пары колосков (Kiesselbach, 1949).Каждый колоск дает один цветочек (нижний цветочек обрывается), который при опылении дает одно ядро ​​(Cheng et al., 1983). Колоски в колосе сидячие, поэтому спаривание не очевидно, но оно приводит к четному количеству рядов ядер в зрелом колосе. У мутантов Sos1 в ухе было меньше ядер (рис. 1D). Количественная оценка показала, что общее количество ядер было уменьшено у мутантов Sos1 / + и Sos1 / Sos1 по сравнению с нормальными ушами (рис.1E). Также наблюдалось сокращение числа рядов ядер с мутантами Sos1 / + , дающими переменное количество рядов, и мутантами Sos1 , дающими менее половины числа рядов нормальных братьев и сестер (рис. 1F).

Чтобы определить основу развития для производства меньшего количества ветвей и колосков у мутантов Sos1 , СЭМ-анализ был выполнен на развивающихся кистях и ушах. В нормальных соцветиях ВП производятся из ИМ на верхушке соцветия (рис.2А). Затем SPM производит два SM (рис. 2, A и D). На идентичность меристемы как SM указывает образование чешуек, защитных листоподобных органов, которые являются первыми органами, продуцируемыми SM (Cheng et al., 1983). Наружная чешуйка образуется на абаксиальной стороне SM, а внутренняя чешуйка формируется внутри внешней чешуи на адаксиальной стороне SM (рис. 2D). Во время развития уха мутанты Sos1 / + и Sos1 / Sos1 продуцировали SPM как обычно, за исключением того, что рядов оказалось меньше (рис.2, Б и В). Позже в развитии ушей, когда парные SMs были видны в нормальных ушах, Sos / Sos1 мутантов имели одиночные SMs, а Sos1 / + мутантов имели смесь одиночных и парных SM (Fig. 2, D-F). Аналогичным образом, в метелке SPM нормальных растений продуцировали два SM (рис. 2G), в то время как мутанты Sos / Sos1 продуцировали одиночные SM (рис. 2I), а мутанты Sos1 / + продуцировали один или два SM (рис. 2H). Следовательно, у мутантов Sos1 и SPM продуцируют один SM вместо двух.

соцветий Sos1 . От А до С, СЭМ ушей 8-недельного возраста. A, Нормальное ухо производит ряды SPM на кончике уха, которые переходят в производство парных SM ниже кончика. B, Sos1 / + ухо, производящее одиночный или парный SM. C, Sos1 / Sos1 ушко, производящее одиночный SM. От D до F, большее увеличение SM в ухе. D, Нормальное ухо с парным СМ. Наружная чешуйка (og) и внутренняя чешуя (ig) являются первыми органами, производимыми SM.E, Sos1 / + ухо, производящее одиночный или парный SM. F, Sos1 / Sos1 ухо с одиночным SM. G, обычная кисточка, создающая парные SM. H, Sos1 / + кисточка с парным SM вверху и одиночным SM у основания. I, Sos1 / Sos1 кисточкой, производящей ряды одиночных SM. Масштабная шкала = 100 мкм м от A до C и от G до I и 50 мкм м от D до F.

Если бы единственным дефектом мутантов Sos1 было образование одиночных, а не парных колосков, то можно было бы ожидать, что мутанты производят ровно половину нормального количества рядов ядра.Однако мутанты Sos1 / Sos1 продуцировали менее половины нормального числа рядов ядра (Fig. 1F; Doebley et al., 1995). Более того, мутанты Sos1 / Sos1 продуцировали менее половины нормального количества колосков в кисточке (рис. 1С). Это указывает на дополнительный дефект в инициировании SPM. Для количественной оценки дефекта в инициировании SPM был использован анализ SEM для подсчета количества SPM, инициированных по окружности IM. Это показало, что нормальные уши производили 9 или 10 SPM, Sos1 / + давали в среднем 7.37 ± 0,33 SPM, в то время как Sos1 / Sos1 дает в среднем 6,14 ± 0,34 SPM (рис. 3A).

Анализ IM мутантов Sos1 . A, Количественная оценка количества SPM, образовавшегося по окружности кончика ушей Sos1 . B, Измерение ширины IM. C, Измерение высоты IM. От D до F, SEM IM нормальных, Sos1 / + и Sos1 / Sos1 ушей. Масштабная линейка = 50 мкм м.

Для дальнейшего анализа дефектов инициации SPM соцветия заливали воском, делали срезы и окрашивали толуидиновым синим О (ТВО).Около кончика уха были видны СЗМ кольцом по окружности соцветия. В сечениях, показанных на фиг. 4, нормальное ухо инициировало девять SPM (фиг. 4A), гетерозиготное ухо инициировало восемь SPM (фиг. 4B), а гомозиготное ухо инициировало шесть SPM (фиг. 4C). Позже, когда нормальные SPM инициируют два SM (рис. 4D), некоторые из SPM у мутантов Sos1 / + инициировали два SM (рис. 4E), в то время как очень немногие из SPM у мутантов Sos1 / Sos1 инициировали два SM. (Рис.4F). Вместо этого SPMs конвертируются непосредственно в SM, что подтверждается образованием чешуек (Fig. 4F).

Поперечные срезы ушей Sos1 , окрашенные ТВО. От А до С: поперечные сечения ушей около кончика уха на стадии производства СЗМ. A, Нормальное ухо показывает девять SPM, некоторые из которых только начинают формировать SM. B, Sos1 / + ухо показывает восемь SPM. C, Sos1 / Sos1 ушей, показывающих шесть SPM. От D до F, поперечные сечения позже в развитии, когда нормальные уши дали парные SM.D — Нормальное ухо с девятью парами SM. Обратите внимание, что внешняя чешуйка (g) видна на некоторых SM. E, Sos1 / + ухо, в котором два из восьми SPM производят два SM. F, Sos1 / Sos1 ухо, в котором видны шесть одиночных SM. Все SM производят чешуйки (g). Масштабная линейка = 100 мкм м. [Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

Производство меньшего количества SPM могло произойти из-за первичного дефекта в размере IM. Таким образом, высота и ширина IM были измерены в Sos1 и нормальных ушах с помощью анализа SEM (рис.3, Г – Е). Это показало, что Sos1 / Sos1 IM были на 80% шире нормальных соцветий, хотя разница была на грани статистической значимости (рис. 3B; P = 0,059). Кроме того, Sos1 / Sos1 IM в среднем составляли 71% от роста нормальных IM, и эта разница была статистически значимой (рис. 3C; P = 0,014). Sos1 / + IM были промежуточными по размеру между нормальными и Sos1 / Sos1 мутантами. Следовательно, мутанты Sos1 продуцируют меньше SPM, предположительно из-за первичного дефекта в размере IM.

Таким образом, гистологический анализ и анализ SEM показывают, что мутанты Sos1 производят меньше колосков по двум причинам: (1) количество рядов SPM меньше; и (2) SPM непосредственно преобразуются в SM, не инициируя второй SM, что приводит к образованию одиночных, а не парных колосков.

Анализ фенотипа Sos1 показал, что растения, гомозиготные по мутации Sos1 , имели более тяжелый фенотип, чем растения, гетерозиготные по Sos1 , и, следовательно, мутация является полудоминантной.Были определены четыре типа доминантных мутаций (Muller, 1932). Двумя типами мутаций с усилением функции являются мутации неоморфа, которые наделяют новую функцию, и мутации гиперморф, которые вызывают повышенную экспрессию гена. Два типа мутаций с потерей функции — это гипоморф и антиморф. Мутации гипоморфа также называют гапло-недостаточными или чувствительными к дозе мутациями, потому что одной копии гена дикого типа недостаточно для функционирования. У антиморфов, которые также называют доминантно-отрицательными мутациями, мутантная копия гена нарушает функцию гена дикого типа (Veitia, 2007).

Чтобы различать эти типы мутаций, используется анализ доз, чтобы варьировать дозу копии гена дикого типа в мутантном фоне (Greene and Hake, 1994). У неоморфа не будет эффекта варьирования дозы (Freeling and Hake, 1985; Poethig, 1988), в то время как у гиперморфа увеличение числа копий дикого типа приведет к более серьезному фенотипу (Kessler et al. , 2002). С другой стороны, у гипо- и антиморфов добавление копий дикого типа может ослабить фенотип (Poethig, 1988; Nelson et al., 2002). Гипоморфа можно отличить от антиморфа, глядя на эффект изменения числа копий гена дикого типа на фоне дикого типа. Удаление одной копии гена дикого типа вызовет видимый фенотип, если ген был гапло-недостаточным и мутация была гипоморфной, но не в том случае, если мутация была антиморфной.

Для определения фенотипического эффекта варьирования дозы sos1 дикого типа пыльцу гиперплоидов линии транслокации B-A, TB-4Sa, скрещивали с нормальными растениями или растениями, гетерозиготными по Sos1 .Скрещивание F ₁ было проанализировано на уровень плоидности (путем подсчета абортов пыльцы; см. «Материалы и методы») и на серьезность фенотипа (путем подсчета процента одиночных колосков в кисточке и количества ядер в ухе. ). Эти результаты показали, что Sos1 растений с дополнительной копией короткого плеча хромосомы 4 ( Sos1 / + / + , гиперплоид) имели более слабый фенотип, чем растения, у которых отсутствовала нормальная копия короткого плеча хромосомы 4 ( Sos1 / — , гипоплоид), так как у них был более высокий процент парных колосков (рис.5А). Аналогичные результаты наблюдались и в ухе (данные не показаны). Эти результаты показывают, что Sos1 не является неоморфом, так как имел место эффект варьирования дозировки гена, а не гиперморф, поскольку гиперплоид не был более серьезным, чем гипоплоид.

Анализ дозировки. A, процент парных (серая полоса) по сравнению с одиночными (белыми) колосками у растений Sos1 , содержащих две копии хромосомы 4S дикого типа (гиперплоид) или отсутствующих короткое плечо хромосомы 4 (гипоплоид).B. Процент парных (серых) по сравнению с одиночными (белыми) колосками в нормальных растениях, содержащих три копии хромосомы 4S дикого типа (гиперплоид) или одну копию хромосомы 4S дикого типа (гипоплоид).

Чтобы определить, был ли Sos1 гипоморфной или антиморфной мутацией, мы создали серию доз для хромосомы 4S на генетическом фоне дикого типа. Нормальные растения, у которых отсутствует одна копия короткого плеча хромосомы 4, не имеют фенотипа Sos1 . Как в гипоплоиде (+/-), так и в гиперплоиде (+ / + / +) были в основном парные колоски (рис.5Б). Этот результат показывает, что ген sos1 дикого типа не является гапло-недостаточным и, следовательно, мутация Sos1 не является гипоморфом. Таким образом, мутация Sos1 , вероятно, является антиморфной или доминантно-отрицательной мутацией.

Sos1 мутанты имеют одиночные, а не парные колоски, потому что SPM производят один вместо двух SM. Следовательно, SPM более детерминирован, чем обычно, у мутантов Sos1 .Следовательно, ген sos1 можно рассматривать как негативный регулятор детерминированности SPM. У мутантов ra1 SPM являются неопределенными, что приводит к образованию сильно разветвленных кисточек и ушей (рис. 6, A и C; Gernart, 1912; Vollbrecht et al., 2005). Ген ra1 интерпретируется как положительный регулятор детерминированности SPM (Vollbrecht et al., 2005). Поскольку мутанты Sos1 и ra1 имеют противоположные эффекты на детерминированность SPM, мы проверили, действуют ли соответствующие гены по одному и тому же пути, создав двойные мутанты.

Генетическое взаимодействие между Sos1 и ra1 . A, фотография зрелой кисточки всех генетических классов семейства F ₂ , разделяющих на Sos1 и ra1 . B. Классификация количества различных типов подмышечных структур, производимых кисточкой. C. Фотография зрелых ушей всех генетических классов семейства F ₂ , разделяющих на Sos1 и ra1 . D к G, СЭМ соцветия початка.D, нормальное ухо, показывающее ряды парных SM. E, ra1 ухо, которое сильно разветвлено, так как все SPM преобразованы в ответвления. Ф, Сос1 / +; ra1 / ra1 ухо, в котором SPM производят дополнительные SM, но не так много, как ra1 . Г, Сос1 / Сос1; ra1 / ra1 колос, в котором SPM в основном дают одиночные колоски. На одной стороне наконечника нет SPM (стрелка). Масштабная линейка = 100 мкм м.

В кисточке, Сос1 / Сос1; Двойные мутанты ra1 / ra1 были менее разветвленными, чем одиночные мутанты ra1 (рис.6А). Чтобы количественно оценить эффекты обеих мутаций, ветви на кистях были удалены, классифицированы и подсчитаны с использованием схемы, аналогичной той, которая использовалась для анализа ra1 (рис. 6B; Vollbrecht et al., 2005). Нормальные растения производят ветви, прежде чем резко переключиться на производство пар колосков. ra1 мутанты продуцируют несколько промежуточных продуктов между ветвями и парами колосков (Vollbrecht et al., 2005). Эти промежуточные продукты включают «смешанные ветви», которые представляют собой ветви со смесью одиночных и парных колосков; «Колосковые мультимеры» — ветви с одиночными колосками; и «тройные колоски».Наш анализ подтвердил, что, как и в предыдущем отчете (Vollbrecht et al., 2005), мутанты ra1 имели градацию фенотипа от ветвей до пар колосков с отсроченным переключением на идентичность SPM по сравнению с нормальным (рис. 6B). . Было обнаружено, что ветви в Sos1 мутантов являются смешанными ветвями, а не истинными ветвями (Рис. 6B). Sos1 мутанты давали меньше типов ветвей в целом и, следовательно, имели более ранний переход к идентичности SPM, чем обычно. В Сос1 / Сос1; ra1 / ra1 , было подавление фенотипа ra1 .Ветви были заменены смешанными ветвями, и было меньше всех типов ветвей по сравнению с одиночными мутантами ra1 (рис. 6В).

Уменьшение количества типов филиалов в Сос1 / Сос1; Двойные мутанты ra1 / ra1 потенциально могут быть объяснены тем фактом, что мутанты Sos1 продуцируют меньше SPM (Fig. 3A). Итак, мы также оценили процент типов ветвей по сравнению с общим количеством подмышечных структур, создаваемых кисточкой. В этом случае мутация Sos1 все еще оказывала подавляющее действие на фенотип ra1 , поскольку процент всех типов ветвей снижался с 41.8% в ra1 одиночных мутантов до 18,7% в Sos1 / Sos1; ra1 / ra1 двойных мутантов. Следовательно, даже с учетом продукции меньшего количества SPM мутантами Sos1 , ветвление в двойной мутантной метелке подавлялось.

Подавление фенотипа ra1 Sos1 было даже более очевидным в ухе, чем в кисточке. Уши растений Sos1 / +; ra1 / ra1 были менее разветвленными, чем ra1 , и даже инициировали некоторые жизнеспособные ядра, что случается очень редко у одиночных мутантов ra1 .Кроме того, в Sos1 / Sos1; У двойного мутанта ra1 / ra1 ветвление было почти полностью подавлено. В самых крайних примерах уши выглядели как Sos1 , за исключением того, что они были меньше и более бесплодны (рис. 6C).

Для исследования онтогенетической основы подавления ra1 с помощью Sos1 , SEM-анализ был выполнен на ушах семей, сегрегированных по обеим мутациям. В нормальных ушах SPM производит два SM (рис. 6D), в то время как в ra1 ушах каждый SPM становится неопределенным и разветвляется, чтобы непрерывно производить SM повторяющимся образом (рис.6E). Сос1 / +; ra1 / ra1 были подавлены по сравнению с ra1 (рис. 6, E и F). Кончик напоминал Sos1 , но у основания уха SPM разветвлялся, чтобы продуцировать множественные SM, хотя и не так много, как у мутантов ra1 (Fig. 6F). В тяжелых случаях Сос1 / Сос1; ra1 / ra1 произвел уши, похожие на Sos1 (рис. 6G). Более того, у двойных мутантов иногда наблюдалось бесплодное пятно вдоль стороны уха (стрелка, рис. 6G), фенотип, который не наблюдался ни у одного из одиночных мутантов.Этот бесплодный фенотип также был виден в зрелом ухе (рис. 6С). Следовательно, мутация Sos1 подавляла фенотип мутации ra1 как в кисточке, так и в ухе.

ra2 также работает в детерминировании SPM. У мутантов ra2 SPM становится неопределенным и дает дополнительные ветви и колоски в кисточке (рис.7А; Кемптон, 1923 г .; Никерсон и Дейл, 1955; Bortiri et al., 2006a). Однако ухо поражено лишь незначительно из-за нерегулярной гребли и случайных ветвей (рис. 7E). ra2 также играет уникальную роль в развитии соцветий, поскольку, в отличие от ra1 , ветви кисточки вертикальные, а ножки колосков удлиненные у мутантов ra2 (Bortiri et al., 2006a). Предполагается, что ra2 действует выше ra1 (Vollbrecht et al., 2005; Bortiri et al., 2006a).

Генетическое взаимодействие между Sos1 и ra2 . A, фотографии зрелой кисточки всех генетических классов семейства F ₂ , разделяющего на Sos1 и ra2 . B. Классификация количества различных типов подмышечных структур, производимых кисточкой. В, Увеличенное изображение отдельных ветвей, произведенных в Сос1 / +; ra2 / ra2 кисточки двойных мутантов. D, вид крупным планом абортированных колосков, произведенных в Sos1 / Sos1; ra2 / ra2 кисточки двойных мутантов.E, фотография зрелого уха всех генетических классов семейства F ₂ , разделяющих на Sos1 и ra2 . F, вид крупным планом подмышечных структур, образовавшихся в ушах семейства двойных мутантов. Нормальный и ra2 дают два ядра в ряду, мутантов Sos1 дают одно ядро ​​в ряду, Sos / +; ra2 / ra2 производят длинные ответвления с несколькими ядрами, Sos1 / Sos1; ra2 / ra2 дает длинные стерильные ветки без ядер. G к J, СЭМ соцветия колоса.G — Нормальное ухо, показывающее ряды парных SM. H, ra2 ухо, в котором SPM образуют три SM или случайные ответвления. И, Сос1 / +; ra2 / ra2 колос, в котором СПМ образуют удлиненные ответвления. J, Сос1 / Сос1; ra2 / ra2 колос, в котором SPM образуют бесплодные удлиненные ветви. Масштабная линейка = 100 мкм м.

Чтобы проверить, действует ли sos1 по тому же пути, что и ra2 , были сконструированы двойные мутанты. Удивительно, но Sos1 имел синергетическое взаимодействие с ra2 как в кисточке, так и в ухе (рис.7). Чтобы определить влияние мутации Sos1 на фенотип ra2 в кисточке, ветви были удалены, классифицированы и количественно определены с использованием той же системы классификации, которая использовалась ранее для ra1 и ra2 (Vollbrecht et al., 2005; Bortiri et al., 2006a). Мутанты ra2 , такие как ra1 , продуцировали промежуточные звенья между ветвями и колосками вдоль основного колоса, за исключением того, что фенотип был более слабым, чем ra1 (рис.7B; Vollbrecht et al., 2005; Bortiri et al., 2006a). Одиночные мутанты Sos1 и ra2 оказали небольшое влияние на общее количество подмышечных структур, продуцируемых кисточкой (Рис. 7B; Bortiri et al., 2006a). Поразительно, но произошло резкое (более чем в 3 раза) уменьшение общего количества подмышечных структур, производимых Sos1 / Sos1; ra2 / ra2 двойных мутантов по сравнению с любым одиночным мутантом (фиг. 7B). Одиночные мутанты Sos1 и ra2 дают небольшое количество рудиментарных колосков с 1-2 чешуей без цветков (так называемые абортированные колоски).Подмышечные структуры, произведенные в Сос1 / Сос1; Двойные мутанты ra2 / ra2 почти полностью состояли из абортированных колосков (рис. 7, B и D). Мы интерпретируем эти фенотипы как синергетическое усиление дефектов ra2 .

В Сос1; ra2 с двойным мутантным ухом, усиление фенотипа ra2 также было очевидным. Колосья мутантов ra2 лишь изредка дают ответвления (Vollbrecht et al., 2005; Bortiri et al., 2006а). Однако Sos1 / +; ra2 / ra2 и Sos1 / Sos1; Уши ra2 / ra2 были намного более разветвленными, чем уши ra2 (рис. 7E). Сос1 / +; ra2 / ra2 производил ответвления с несколькими ядрами на них, а Sos1 / Sos1; Ветви ra2 / ra2 были длинными и бесплодными (рис. 7F).

Чтобы понять основу развития для повышенного ветвления и бесплодия Sos1; ra2 двойные мутантные уши, СЭМ-анализ проводили на развивающихся ушах.В нормальных ушах SPMs продуцируют два SM (рис. 7G), тогда как у мутанта ra2 SPM продуцируют более двух SM и иногда появляются ответвления (рис. 7H). Sos1 / +; Мутанты ra2 / ra2 были более разветвленными, чем ra2 , причем каждый SPM ветвился несколько раз (фиг. 7I). Ветви были более вытянутыми, чем ra2 , и давали мало SM (рис. 7, H и I). В Сос1 / Сос1; ra2 / ra2 , фенотип был дополнительно усилен удлиненными ветвями вместо SPM и даже меньшим количеством SM (рис.7J). Следовательно, Sos1 усиливал фенотип мутанта ra2 как в кисточке, так и в ухе.

ra3 также действует в детерминированности меристемы, хотя фенотип слабее, чем ra1 и ra2 (Satoh-Nagasawa et al., 2006). В кисточке мутанты ra3 дают несколько сверхдлинных ветвей, но не имеют дефектов детерминированности, наблюдаемых у мутантов ra1 и ra2 (данные не показаны).В ухе мутанты ra3 имеют неправильные ряды и ветви у основания уха (Рис. 8B; Satoh-Nagasawa et al., 2006). Эти дефекты вызваны превращением SPM в ветви и SM, производящие дополнительные структуры, включая дополнительные FM (Fig. 8F; Satoh-Nagasawa et al., 2006). В Сос1 / +; Уши двойного мутанта ra3 / ra3 , ветви образовывались у основания уха, а одиночные колоски образовывались на кончике уха (фиг. 8C). Кроме того, аналогично одиночным мутантам ra3 , Sos1 / +; Колоски ra3 / ra3 давали дополнительные FM (рис.8G). Сос1 / Сос1; уши двойного мутанта ra3 / ra3 имели фенотип, сходный с фенотипом Sos1 / +; ra3 / ra3 , за исключением того, что фенотип Sos1 был очевиден на большей части уха (рис. 8D). Анализ SEM показал, что неопределенный SPM был произведен в основании уха (рис. 8H). Таким образом, двойные мутанты имели в основном аддитивные дефекты с одиночными рядами колосков, вызванными мутацией Sos1 на кончике, и дополнительными структурами, вызванными мутацией ra3 у основания уха.

Генетическое взаимодействие между Sos1 и ra3 . От A до D, фотографии зрелых ушей из Sos1; ra3 сегрегационная семья. От E до H, SEM анализ ушей от Sos1; ra3 сегрегационная семья. Масштабная линейка = 100 мкм м.

Экспрессия

Для дальнейшего тестирования роли sos1 в пути ramosa был протестирован относительный уровень экспрессии мРНК ra1 , ra2 и ra3 на мутантах Sos1 с использованием количественной обратной транскрипции в реальном времени ( RT) -PCR.Результаты показали, что уровни мРНК ra1 были снижены у мутантов Sos1 / Sos1 (фиг. 9A). Поскольку уровни мРНК ra1 регулируются ra2 и ra3 (Vollbrecht et al., 2005; Satoh-Nagasawa et al., 2006), мы проверили, связано ли снижение экспрессии ra1 с дефектом в Выражение ra2 или ra3 . Однако уровни мРНК ra2 и ra3 не были затронуты у мутантов Sos1 / Sos1 (рис.9, Б и В). Следовательно, мутация Sos1 специфически влияла на уровни экспрессии ra1 .

ra1 , ra2 и ra3 в мутантах Sos1 и модель роли sos1 в детерминированности SPM. От A до C, эксперименты с ОТ-ПЦР в реальном времени, показывающие относительный уровень экспрессии (A) ra1 , (B) ra2 и (C) ra3 в Sos / + и Sos / Sos1 мутанты.C. Модель взаимодействия между генами Sos1 и ramosa . ra1 , ra2 и ra3 необходимы для обеспечения детерминированности SPM. Мы предполагаем, что Sos1 является отрицательным регулятором детерминированности SPM. ra2 и ra3 действуют перед ra1 , а также имеют роли, независимые от ra1 . Ас Сос1; Двойные мутанты ra1 напоминают одиночные мутанты Sos1 , sos1 располагается после ra1 .Ас Сос1; двойные мутанты ra2 обладают улучшенным фенотипом, аналогичным ra1; Двойные мутанты ra2 , sos1 , как предполагается, положительно регулируют ra1 . Сос1; Двойные мутанты ra3 обладают аддитивным фенотипом, что указывает на то, что ra3 действует независимым путем. Модель подтверждается исследованиями экспрессии, показывающими, что ra1 снижается, но ra2 и ra3 не изменились у мутантов Sos1 .

ОБСУЖДЕНИЕ

Самый поразительный недостаток мутантов Sos1 состоит в том, что SPM инициирует один, а не два SM. Кроме того, мутанты Sos1 имеют дефекты в инициации SPM, что, как мы предполагаем, связано с общим уменьшением апикального размера IM. Sos1 мутанты также дают меньше ветвей. Однако получаемые ветви не являются нормальными, а представляют собой смешанные ветви, которые более детерминированы, чем нормальные. После того, как SM продуцируются мутантами Sos1 , они обычно дают два цветочка.Однако небольшой процент прерванных колосков (колосков без цветков) проявляется позже в развитии. О рудиментарных колосках также сообщили Doebley et al. (1995). Следовательно, мутация Sos1 влияет на детерминированность всех меристем, образующихся во время развития соцветий.

Роль

ra1 и ra2 мутанты сильно разветвлены, поскольку SPM являются неопределенными.Следовательно, роль генов ra1 и ra2 заключается в наложении детерминированности на SPM (Vollbrecht et al., 2005; Bortiri et al., 2006a), представленных сплошной стрелкой в ​​модели, показанной на рисунке 9D. ra2 предположительно действует выше ra1 , потому что уровни мРНК ra1 снижены у мутантов ra2 , а двойные мутанты между ra2 и слабым аллелем ra1 имеют усиленный фенотип (Vollbrecht et al ., 2005; Bortiri et al., 2006a; Сато-Нагасава и др., 2006). Кроме того, предполагается, что ra2 будет иметь дополнительные роли, независимые от ra1 (Bortiri et al., 2006a).

У мутантов Sos1 SPM более детерминированы, чем обычно, производя один SM вместо двух. Мутация Sos1 является антиморфом, который представляет собой тип доминантной мутации потери функции (точнее, антагонист функции дикого типа). Следовательно, у мутантов Sos1 отсутствие нормальной функции гена sos1 вызывает повышение детерминированности.Одна интерпретация функции дикого типа гена sos1 заключается в противопоставлении детерминированности SPM, представленной полосой на фиг. 9D. Другой способ описания этого состоит в том, что ген sos1 придает неопределенность SPM, но поскольку SPM обычно является детерминированным, мы предполагаем, что sos1 подавляет детерминированность. Поскольку ген sos1 ингибирует детерминированность SPM, в то время как гены ramosa способствуют детерминированности SPM, были сконструированы двойные мутанты для проверки генетического взаимодействия между генами sos1 и ramosa .Удивительно, но мы обнаружили разницу во взаимодействии между sos1 и ra1 , ra2 и ra3 .

Мы предлагаем модель, показанную на рисунке 9D, для учета всех данных генетического взаимодействия и экспрессии. Сос1; Двойные мутанты ra1 напоминают одиночные мутанты Sos1 . Поскольку одиночные мутанты Sos1 и ra1 имеют противоположные фенотипы, мы интерпретируем результат двойного мутанта как означающий, что ген sos1 дикого типа функционирует ниже ra1 (рис.9D; Эйвери и Вассерман, 1992). Следовательно, ra1 может придавать детерминированность SPM путем отрицательной регуляции гена sos1 . Неожиданно Сос1; Двойные мутанты ra2 имели улучшенный фенотип по сравнению с одиночными мутантами ra2 . Sos1; Двойной мутант ra2 поразительно похож на двойной мутант между ra2 и слабым аллелем ra1 (Vollbrecht et al., 2005). Одной из гипотез, объясняющих усиление фенотипа ra2 за счет мутации Sos1 , было бы, если ген sos1 положительно регулировал ген ra1 .В поддержку этой гипотезы, уровни мРНК ra1 и снижены у мутантов Sos1 . Следовательно, мы предполагаем, что sos1 действует в ветви ra1 пути ramosa , обеспечивая петлю отрицательной обратной связи для контроля детерминированности SPM (рис. 9D).

ra3 также предположительно действует перед ra1 , хотя, поскольку ra3 кодирует трегалозо-6-фосфатфосфатазу, это взаимодействие может быть не прямым (Satoh-Nagasawa et al., 2006). ra3 мутанты имеют слабые дефекты в детерминированности SPM, указывая тем самым, что ra3 также играет роль в детерминированности SPM (Satoh-Nagasawa et al., 2006). Сос1; Двойные мутанты ra3 имели в основном аддитивные дефекты, что означает, что sos1 и ra3 действуют независимыми путями.

Мутация Sos1 оказывала более подавляющее действие на фенотип ra1 в ухе, чем кисточка. Альтернативная интерпретация фенотипа метелки Sos1; ra1 будет заключаться в том, что мутации Sos1 и ra1 обладают аддитивным эффектом, что указывает на то, что sos1 действует независимо от пути ra1 .Однако снижение экспрессии ra1 в мутантах Sos1 не поддерживает независимого взаимодействия. Более того, поскольку иногда наблюдается полное подавление фенотипа ra1 в Sos1; ra1 , мы поддерживаем гипотезу о том, что разница между фенотипами двойных мутантов кисточки и уха обусловлена ​​различиями в модифицирующих факторах между кисточкой и ухом. Различия в выраженности фенотипов метелки и колоса обычны для мутантов по детерминантности соцветий кукурузы (Irish, 1997a, 1997b; Laudencia-Chingcuanco and Hake, 2002; Kaplinsky and Freeling, 2003; Bortiri et al., 2006а). Одно из объяснений состоит в том, что кисточка формируется в апикальном положении, а ухо — в подмышечной, поэтому их гормональная среда, вероятно, различается. Кроме того, была продемонстрирована субфункционализация повторяющихся генов между кисточкой и ухом (Mena et al., 1996). Кроме того, степень ветвления зависит от условий окружающей среды, что указывает на то, что дополнительные модифицирующие факторы могут влиять на ветвление.

Сос1; Двойной мутант ra2 оказывал синергетический эффект на ветвление в ухе.Альтернативная интерпретация: Sos1; Фенотип двойного мутанта ra2 можно считать аддитивным, если, например, мутация ra2 вызвала неопределенность SPM, но SPM не смог инициировать сидячие SM из-за мутации Sos1 . Однако, как SPM в Sos1; Двойные мутанты ra2 более неопределенны, чем одиночные мутанты ra2 , мы заключаем, что взаимодействие между Sos1 и ra2 не аддитивно в ухе.Кроме того, влияние мутации Sos1 на фенотип ra2 в метелке не является аддитивным.

Таким образом, хотя можно представить себе и другие интерпретации, мы отдаем предпочтение модели, представленной на рисунке 9D, потому что она объясняет все фенотипы одиночных и двойных мутантов, а также исследования экспрессии. Доминирующие отрицательные мутации могут быть вызваны мутациями факторов транскрипции, которые, например, могут димеризовать, но не связывать ДНК, или могут связывать ДНК, но не активировать транскрипцию (Veitia, 2007).Основываясь на фенотипе мутанта Sos1 , генетических взаимодействиях с мутантами ra и снижении экспрессии ra1 у мутантов Sos1 , мы предполагаем, что sos1 может кодировать фактор транскрипции, который взаимодействует с ra1 или . ra2 .

Дополнительные роли генов

Помимо влияния на детерминированность SPM, Sos1; ra1 и Sos; Двойные мутанты ra2 имели дополнительные дефекты развития соцветий.Это означает, что соответствующие гены играют дополнительные роли в развитии, которые ранее не были обнаружены. Сос1; Двойные мутанты ra1 давали бесплодные пятна в ухе, которые не наблюдались ни у одного из одиночных мутантов. Это синергетическое взаимодействие можно объяснить функцией обоих генов в SPM. Поскольку ra1 и ra2 не выражаются в апикальном IM, мы предполагаем, что это связано с дефектом самого SPM. Мы пришли к выводу, что, поскольку гены выполняют противоположные функции в SPM, в их отсутствие SPM иногда не запускается.Этот эффект также был замечен в кисточке, поскольку было общее уменьшение количества подмышечных структур, произведенных в Sos1; двойной мутант ra1 . В Сос1; ra2 , было еще более серьезное снижение количества подмышечных структур, образующихся в кисточке. Эти результаты показывают, что гены sos1 , ra1 и ra2 играют перекрывающиеся роли в продукции SPM как в кисточке, так и в ухе.

У одиночных мутантов Sos1 , ra1 и ra2 в кисточке образовывалось небольшое количество абортированных колосков, причем мутанты ra2 имели самый сильный эффект.В Сос1; ra1 , было несколько аддитивное увеличение количества абортированных колосков в кисточке по сравнению с любым одним мутантом. Однако в Сос1; ra2 , было синергетическое увеличение количества абортированных колосков. Фактически, почти все колоски, образовавшиеся в кисточке с двойным мутантом, были абортированы. Поэтому мы предлагаем, чтобы sos1 , ra1 и ra2 также работали в SM. Однако SM все еще не определены у двойных мутантов Sos1; ra3 , аналогичных одиночным мутантам ra3 , что указывает на то, что роль sos1 не зависит от ra3 в SM.

Роль

Sos1 мутанты имеют меньший апикальный IM и меньшее количество SPM. Мы утверждаем, что дефекты в инициировании SPM происходят из-за дефектов в размере IM, поскольку есть другие примеры, когда увеличение или уменьшение размера меристемы влияло на инициирование SPM. Например, узловатых1 ( kn1 ) мутантов с потерей функции, которые также производят меньше ветвей и колосков в соцветии, уменьшили размер SAM в некоторых генетических фонах, хотя разницы в размере IM не было. продемонстрировано (Kerstetter et al., 1997; Vollbrecht et al., 2000). Противоположный фенотип наблюдается у мутантов толстых кисточек1 ( td1 ) и фасциированных ушей2 ( fea2 ), которые имеют более крупный IM и производят больше SPM (Taguchi-Shiobara et al., 2001; Bommert et al ., 2005). Интересно, что один из аллелей ra3 , ra3-fae1 , был первоначально идентифицирован как имеющий фасцитированный фенотип уха (Satoh-Nagasawa et al., 2006), что указывает на то, что путь ramosa может иметь косвенное влияние на IM. . abphyl1 ( abph2 ) мутанты, которые влияют на филлотаксию листа, также имеют более крупную SAM (Jackson and Hake, 1999). abph2 кодирует регулятор цитокининового ответа, который негативно регулирует передачу сигналов цитокинина (Giulini et al., 2004). Кроме того, мутации, которые влияют на уровни цитокининов в рисе, также влияют на количество колосков (Ashikari et al., 2005; Kurakawa et al., 2007). Предполагается, что дефекты у мутантов kn1 , td1 и fea2 связаны с первичным дефектом уровней цитокининов (Barazesh and McSteen, 2008b), поскольку уровни цитокинина коррелируют с размером меристемы у eudicots (Sakakibara , 2006; Kyozuka, 2007).Имеют ли мутанты Sos1 дефекты в уровнях цитокининов или передаче сигналов, еще предстоит определить. Поскольку мутанты Sos1 и влияют на размер IM и детерминированность BM и SPM, мы предполагаем, что имеется сходный основной дефект в поддержании или детерминированности как апикальных, так и подмышечных меристем.

Играет ли ауксин роль в функции

Одиночные колоски на ножке также характерны для мутаций, влияющих на транспорт ауксина.Например, бесплодных соцветий1 ( Bif1 ) и bif2 мутантов, которые дефектны в транспорте ауксина, продуцируют одиночные колоски (McSteen and Hake, 2001; McSteen et al., 2007; Barazesh and McSteen, 2008a). бесплодный стебель1 ( ba1 ), который, как предполагается, действует как выше, так и ниже по потоку транспорта ауксина, также при мутации дает единичные колоски (Ritter et al., 2002; Gallavotti et al., 2004, 2008; Wu and McSteen, 2007; Скирпан и др., 2008). Более того, обработка нормальных соцветий кукурузы ингибиторами транспорта ауксина на более поздних этапах развития приводит к образованию единичных колосков (Wu and McSteen, 2007). Следовательно, транспорт ауксина необходим для инициирования сидячих колосков. Генетический анализ показывает Sos1; Двойные мутанты bif2 похожи на bif2 (дополнительный рисунок S1). Аналогично, ba1 эпистатичен Sos1 (дополнительный рисунок S1). Это можно интерпретировать как означающее, что sos1 действует по тому же пути, что и bif2 и ba1 , поскольку Sos1 , по-видимому, не усиливает фенотип bif2 или ba1 .Однако фенотипы bif2 и ba1 настолько серьезны, что было бы трудно увидеть улучшение. Таким образом, неясно, играет ли sos1 роль в обеспечении возможности ауксина, прямо или косвенно, инициировать сидячую SM.

В заключение, мы в настоящее время занимаемся точным картированием Sos1 для идентификации гена с помощью позиционного клонирования (Bortiri et al., 2006b). Клонирование гена sos1 позволит выяснить молекулярную основу его взаимодействия с путем ramosa .Более того, клонирование sos1 даст представление о его предполагаемой роли в эволюции парных колосков. Поскольку ra1 был идентифицирован только у Andropogoneae, было бы интересно определить, кооптировалось ли sos1 в тот же момент времени во время диверсификации трав.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рост растений и характеристика зрелого фенотипа

Аллель Sos1-Reference был получен из Центра сотрудничества генетики кукурузы (запас 427I) и шесть раз скрещен с генетическим фоном B73 кукурузы ( Zea mays ).Анализ зрелого фенотипа проводили на растениях, выращиваемых в Рок-Спрингс, штат Пенсильвания, летом. Растения были генотипированы как гетерозиготы или гомозиготы Sos1 с использованием SSR-маркера umc1294 , который является ближайшим генетическим маркером, идентифицированным на данный момент (umc1294F, 5′-GCC GTC AAC GGG CTT AAA CT-3 ‘и umc1294R, 5’-GCC TCC ACG TCT CTC GTC TCT T-3 ′). Для характеристики фенотипа кисточки и колосья собирали по достижении зрелости у нормальных Sos1 / + и Sos1 / Sos1 растений из сегрегированных семейств.Количество ветвей и количество парных колосков по сравнению с одиночными на главном колосе подсчитывали на кистях после цветения. Размер выборки составил 28 нормальных, 35 Sos1 / + и 33 Sos1 / Sos1 в данных, представленных на рис. 1, B и C. Число ядер подсчитывали на открытых опыленных початках. Размер выборки был 16 нормальных, 13 Sos1 / + и 10 Sos1 / Sos1 в данных, представленных на Рисунках 1, E и F.

СЭМ и гистология

Незрелые колосья (5–20 мм) собирали с растений, выращиваемых в течение 8 недель летом в Рок-Спрингс, штат Пенсильвания.Незрелые кисточки (3–6 мм) получали от 5-недельных растений, выращенных весной в теплице с дополнительным освещением. И кисточки, и ушки были закреплены и подготовлены для SEM, как описано (Wu and McSteen, 2007). Количество SPM по окружности апикального IM определялось путем установки верхней части уха на заглушку SEM и просмотра образцов сверху ( n = 11 нормальных, 8 Sos1 / + и 7 Sos1 / Сос1 ). Для измерения размера IM образцы колосов просматривали сбоку, и ширину IM измеряли поперек меристемы непосредственно над точкой, где были видны примордии прицветника, а высоту измеряли перпендикулярно от этой линии к верхушке соцветия ( n = 7 нормальных, 7 Sos1 / + и 6 Sos1 / Sos1 ).Кроме того, кисточки и ушки заливали воском и делали срезы для окрашивания ТВО, как описано (Wu and McSteen, 2007).

Анализ дозировки

Анализ дозировки был проведен путем скрещивания известных гиперплоидов линии транслокации B-A, TB-4Sa (помеченных sugary1 , Coop Stock 421D) как самцов с нормальными растениями или растениями, гетерозиготными по Sos1 . TB-4Sa — это реципрокная транслокация короткого плеча хромосомы 4 с сверхнормальной B-хромосомой, которая из-за очень высокой скорости нерасхождения во время второго митотического деления развития пыльцы дает пыльцу с двумя или нулевыми копиями хромосома 4S (Роман, 1947; Беккет, 1978, 1994).Плоидность потомства F ₁ может быть определена по скорости аборта пыльцы (Роман, 1947; Карлсон, 1994). Аборты пыльцы оценивали с помощью карманного микроскопа по утрам подряд, когда пыльники начинали отделять свежую пыльцу (Phillips, 1994). Как наблюдалось ранее для TB4Sa, выкидыш пыльцы у гипоплоидных растений составлял 50%, а у гиперплоидных растений — от 2% до 10% (Carlson, 1994; D. Auger, Университет штата Южная Дакота, личное сообщение). Кисточки и ушки гипоплоидов и гиперплоидов собирали по достижении зрелости для фенотипического анализа.Подсчитывали процент парных и одиночных колосков на 15-сантиметровом участке главного колоса кисточки после цветения. Для анализа, показанного на рисунке 4, размеры образцов составляли 13 Sos1 / + / + , 6 Sos1 / — , 8 + / + / + и 4 +/- кисточек.

Анализ двойных мутантов

Все семьи, разделяющие двойные мутанты, были созданы на генетическом фоне B73 и были высажены летом в Рок-Спрингс, штат Пенсильвания, в течение двух полевых сезонов. На каждую комбинацию двойных мутантов ежегодно высаживали не менее 360 растений.Все растения были генотипированы для Sos1 с маркером SSR umc1294 , как описано выше. Каждое семейство двойных мутантов оценивали, и анализ хи-квадрат не смог отклонить ожидаемый коэффициент сегрегации (данные не показаны).

Семьи сегрегационные по Сос1; bif2 и Sos1; ba1 были генотипированы по мутациям bif2 и ba1 , как описано (Skirpan et al., 2008). По мере созревания подсчитывали количество веточек кисточки и колосков на главном колосе.Для анализа, показанного на дополнительном рисунке S1B, размер выборки был 2 нормальным, 4 Sos1 / + , 11 Sos1 / Sos1 , 17 bif2 / bif2 , 13 Sos1 / +; bif2 / bif2 и 13 Сос1 / Сос1; Биф2 / Биф2 . Для анализа, показанного на дополнительном рисунке S1D, размер выборки был 2 нормальных, 5 Sos1 / + , 7 Sos1 / Sos1 , 11 ba1 / ba1 , 11 Sos1 / +; ba1 / ba1 и 8. Сос1 / Сос1; ba1 / ba1 .

Семьи раздельные Sos1; ra1 и Sos1; ra2 оценивали и анализировали фенотип кисточки и ушей в зрелом возрасте (9 недель).Ветви были удалены с кисточек и классифицированы согласно Vollbrecht et al. (2005) и Bortiri et al. (2006a). Для анализа, показанного на рисунке 6B, размер выборки был 4 нормальным, 4 Sos1 / + , 3 Sos1 / Sos1 , 9 ra1 / ra1 , 10 Sos1 / +; ra1 / ra1 и 10 Sos1 / Sos1; ra1 / ra1 . Для анализа, показанного на рисунке 7B, размер выборки был 4 нормальным, 4 Sos1 / + , 6 Sos1 / Sos1 , 6 ra2 / ra2 , 8 Sos1 / +; ra2 / ra2 и Sos1 / Sos1; ra2 / ra2 .Семьи сегрегационные по Сос1; ra3 оценивали только по фенотипу ушей, поскольку фенотип кисточки ra3 был очень слабым.

Все графики показывают среднее значение ± стандартное отклонение от среднего. Значения вероятности были определены на основе двусторонних тестов Стьюдента t , выполненных в Microsoft Excel 2003.

ОТ-ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали из кисточек размером 4-5 мм из нормальных, Sos1 / + и Sos1 / Sos1 растений с помощью набора NucleoSpin RNA Plant (Macherey-Nagel GmbH & Co.). От четырех до шести образцов из каждого класса использовали в качестве биологических повторов, выполняли три технических повтора для каждого биологического повтора, и весь эксперимент повторяли три раза. Синтез кДНК, ОТ-ПЦР в реальном времени и анализ выполняли, как описано (Barazesh and McSteen, 2008a). Для обнаружения экспрессии ra1 зонд Такмана был (FAM-5′-ATC CAC AGG CTG GAC AGG GCC A-3′-BHQ), а праймеры RT-PCR были ra1F (5′-GCT GGG AGG CCA CAT GAA- 3 ‘) и ra1R (5′-GTG AAG TGT ACT GTT GGT GGA TCA G-3’).Для обнаружения экспрессии ra2 зонд Такмана был (FAM-5′-TCG TCA TTA GTA GCT CCC CAG GCG C-3′-BHQ), а праймеры RT-PCR были ra2F (5′-TGC TAC TTC ATG CGG AAC CA-3 ‘) и ra2R (5′-TTA GCC ACG GAA GCG TAA GG-3’). Для обнаружения экспрессии ra3 зонд Такмана был (FAM-5′-CCG TCC ACT TCC GCT GCG TCC-3′-BHQ), а праймеры RT-PCR были ra3F (5′-CCA GGG TGG AGC ACA ACA A- 3 ‘) и ra3R (5’-CTC GTT CAC GGC ATT CCA T). Внутренний контроль для амплификации — убиквитин ( убк ).Для обнаружения экспрессии ubq зонд Taqman был (5′-FAM-AAA TCC ACC CGT CGG CAC CTC C-3 ‘BHQ), а праймеры RT-PCR были ubqF (5’-CTC TTT CCC CAA CCT CGT GTT- 3 ‘) и ubqR (5′-ACG AGC GGC GTA CCT TGA-3’).

Дополнительные данные

В онлайн-версии статьи доступны следующие материалы.

Благодарности

Мы благодарим Эрика Фоллбрехта за указание на сходство между Sos1; ra2 и ra1; двойные мутанты ra2 , Дэвид Барнс и Сара Хейк за первое открытие Sos1; ra2 и двух анонимных рецензентов за полезные предложения.Мы благодарим Деба Гроув из Центра нуклеиновых кислот Института Хака за проведение экспериментов ОТ-ПЦР в реальном времени, Мисси Хейзен из Центра электронной микроскопии Института Хака за обучение работе с SEM, а также Джеффри Бутербо, Джейсона Хоара, Криса Кука, Кима Филлипса, Мэтту Дэвису и Крису Хадсону за помощь в полевых условиях и за генотипирование Sos1 . Мы благодарим Maize Coop за семена Sos1 , Фрэнка Бейкера за семена гиперплоидов TB4Sa и Дона Оже за советы по анализу дозировки туберкулеза. Благодарим Тони Омейса и Скотта Харккома за уход за растениями.Мы благодарим сотрудников лабораторий Макстина и Брауна за обсуждение и комментарии к рукописи.

Сноски

• Автор, ответственный за распространение материалов, составляющих выводы, представленные в этой статье, в соответствии с политикой, описанной в Инструкциях для авторов (www.plantphysiol.org): Паула Макстин (pcm11 {at} psu.edu).

• www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.108.125005

• №1 Работа выполнена при поддержке Пенсильванского государственного университета (стартовые средства П.M. и факультета биологии, ассистент выпускника Генри В. Поппа X.W.).

• ↵ [C] Некоторые рисунки в этой статье отображаются в Интернете в цвете, а в печатном издании — в черно-белом.

• ↵ [OA] Статьи в открытом доступе можно просматривать в Интернете без подписки.

• ↵ [W] Онлайн-версия этой статьи содержит данные только для Интернета.

• Поступила 20.06.2008.
• Принято 3 ноября 2008 г.
• Опубликовано 7 ноября 2008 г.

ЦИТАТА ЛИТЕРАТУРЫ

Commelinidae Cyperales.Poaceae — в основном травы, входящие в самые большие семейства цветковых растений, насчитывающие около 500 родов и 8000 видов. В стебли круглые и обычно полые, по крайней мере, в междоузлиях. Листья очередные, и обычно двухуровневые, проксимально содержащие открытое основание оболочки с перекрытием края и дистально образуют лезвие в форме ремня с параллельными прожилками. На адаксиальном листе поверхность на стыке лезвия и ножен часто представляет собой волосатую бахрому из ткани, называемую язычок. Основная единица соцветия называется колоском, обычно состоящим из базальная пара крошечных стерильных прицветников, называемых чешуйками, и один или несколько дистично расположенных дистальные соцветия на часто зигзагообразном продолжении оси колосков, называемых рахиллами.Каждый цветочек обычно окружен дополнительной парой крошечных пушистых прицветников, называемых лемма и палеа. Цветочки бывают однополыми или двуполыми и обычно имеют два или три едва узнаваемые структуры, называемые lodicules, которые могут представлять собой рудиментарный оборот околоцветник, который раздвигает лемму и палею во время цветения, тем самым облегчая отхождение тычинок и рыльц. Андроций обычно состоит из трех или иногда 6 отчетливых тычинок. Гинецей состоит из одного сложного пестика, состоящего из двух частей. или иногда 3 плодолистика, такое же количество стилей с перистыми рыльцами и более высокий яичник с одной локулой, содержащей от субапикальной до базальной семяпочки.Плод обычно зерновка.

Каждое «эскизное» изображение ниже связано с более крупной фотографией.