Система зайцева: Методика Зайцева: чтение и математика

Бистабильность связанной системы киназа-фосфатаза Aurora B при делении клеток

Рецензенты обсудили рецензии друг с другом, и редактор-рецензент подготовил это решение, чтобы помочь вам подготовить исправленную заявку.В частности, обозреватели были обеспокоены тем, что вы не продемонстрировали наличие бистабильной системы in vivo, поскольку любая комбинация положительной обратной связи и ингибитора может вызвать бистабильное состояние путем настройки параметров. Следовательно, демонстрация этого с использованием нефизиологической фосфатазы при потенциально нефизиологических концентрациях киназы может быть не столь ценной для понимания проблемы.

Наши доказательства бистабильности киназы Aurora B in vivo суммированы в нашем ответе на важный пункт 2a; Относительная незначительность идентичности фосфатаз подчеркнута в нашем ответе на важный пункт 1. Мы согласны с утверждением, что «любая комбинация положительной обратной связи и ингибитора может создать бистабильное состояние путем корректировки параметров», но только в очень широком, теоретическом смысле. Как ученые-экспериментаторы, мы не имеем доступа ко всем возможным параметрам и не можем бесконтрольно их настраивать. Пока мы не очистили киназу Aurora B и не смешали ее с фосфатазой, не было известно, является ли активность Aurora B бистабильной в диапазоне доступных нам концентраций Aurora B. Этот экспериментальный диапазон, который мы изучаем in vitro (до 8 мкМ), является физиологическим, как мы теперь объясняем в нашей статье с рисунками 6 и 8, см. Раздел «Методы» IV Выбор параметров модели.Более того, теперь мы предоставляем пример модифицированной модели киназы-фосфатазы, в которой модифицирован только один параметр для внутримолекулярной аутоактивации Aurora B ( k _цис ). Хотя эта модель все еще включает в себя положительную обратную связь и ингибитор (противодействующий фосфатазе), она не предсказывает бистабильного поведения в физиологическом диапазоне концентраций Aurora B (новый рисунок 6D, E), и наш анализ показывает, что это верно даже для других значений ферментативной параметры для фосфатазы. Следовательно, эта модель не может описать наши экспериментальные данные (рисунок 6E и рисунок 7). Таким образом, общее утверждение о поведении некоторых нелинейных систем не подрывает наших конкретных результатов для киназы Aurora B.

Хотя очевидный гистерезис в ответ на ингибитор Aurora B очень интересен, если ингибитор Aurora B влияет на локализацию Aurora B и соответствующую фосфатазу, то это явление может не иметь ничего общего с бистабильностью, наблюдаемой in vitro.

См. Наш ответ на важные пункты 2a и 9d.

Авторы «предполагают, что бистабильность B-фосфатазной системы Aurora лежит в основе формирования пространственных паттернов фосфорилирования, генерируемых сайтами аутоактивации киназ». Однако неясно, как авторы думают, почему эта бистабильность помогает пространственной регуляции Aurora B-зависимого фосфорилирования. Какие различные пространственные паттерны могут быть однозначно генерированы бистабильным поведением Aurora B-зависимого фосфорилирования? Без критической оценки, кажется, существует значительный разрыв между предложением и доказательствами. Эти моменты описаны более подробно ниже.

См. Наш ответ на важные пункты 2b, 7b и 9f.

Резюме: В этом исследовании авторы рассмотрели вопрос о том, как Aurora B активируется и устанавливает градиент активности в клетке. Авторы используют комбинацию математического моделирования, биохимического восстановления и индуцируемого таргетинга in vivo, чтобы показать, что Aurora B должна быть сконцентрирована в центромерах, чтобы стать активными, что она активирует в цис-, и что это поведение предсказано на основе измерения полярного сияния B. активация in vitro.Они также показывают, что в присутствии фосфатазы активность Aurora B проявляет би-стабильность, которая зависит от концентрации киназы, но не от концентрации фосфатазы. Таким образом, авт. Поддерживают идею, что концентрация Aurora B на центромерах важна для создания градиента Aurora B, и что в присутствии фосфатазы активность Aurora B будет проявлять бистабильное поведение. Существенные изменения: 1) Авторы заявляют, что фосфатазы, противостоящие Aurora B, неизвестны — , хотя значительные данные указывают на важность PP1 —

, но λ (очевидно) не является релевантной фосфатазой in vivo, и, учитывая все недавние работы, показывающие, насколько важна регуляция фосфатазы для митоза, я обеспокоен тем, что игнорирование идентичности противоположной фосфатазы или фосфатаз может подорвать обоснованность выводов. .Восстановление системы с использованием более подходящей фосфатазы было бы обнадеживающим.

Значительные доказательства указывают на то, что PP1 действует на те же клеточные субстраты, что и киназа Aurora B, но нам не известны убедительные доказательства того, что эта фосфатаза регулирует комплекс Aurora B / INCENP в клетках. И PP1, и PP2A были связаны с Aurora B (например, Sugiyama et al. 2002, Oncogen), но их относительная важность и соответствующие регуляторные субъединицы неизвестны. Регуляторные субъединицы особенно важны, поскольку они обеспечивают субстратную специфичность для каталитических субъединиц, поэтому использование одной каталитической субъединицы не сделает восстановление более физиологичным.Кроме того, явление би-стабильности в нашей связанной системе киназа-фосфатаза не обязательно зависит от идентичности или конкретных характеристик фосфатазы. Действительно, наш теоретический анализ («Анализ зависимости бистабильности от каталитических констант для фосфатазы» части III Материалов и методов: Теоретическое моделирование экспериментов in vitro) демонстрирует, что кинетика аутоактивации киназы Aurora B является движущей силой для этого би -стабильная система, при этом характеристики фосфатаз не так важны. Как заметил один рецензент, фосфатаза в нашем восстановлении просто обеспечивает «трение, с которым киназа работает против», поэтому мы считаем, что нынешнее отсутствие знаний об идентичности физиологической фосфатазы не является вредным. Наконец, нам не известно ни о каком опубликованном подробном анализе, теоретическом или воссозданном, бистабильности киназы Aurora B с какой-либо фосфатазой, поэтому наша работа по обнаружению и характеристике этого явления представляет собой концептуально новый прогресс. Поскольку нам нужно было расставить приоритеты по повторной подаче документов в отведенное время, мы решили сосредоточиться на других вопросах, в которых наши усилия могли бы оказать большее влияние.

2) Требуются дополнительные доказательства, чтобы поддержать их утверждение, что Aurora B и фосфатаза могут формировать бистабильность в физиологическом контексте.

a) Мы полагаем, что доказательства, которые мы уже представили для бистабильности Aurora B-зависимого фосфорилирования in vivo, довольно сильны, потому что они ясно показывают два различных состояния фосфорилирования, присутствующих одновременно в идентичных условиях в клеточной популяции (предыдущие рисунки 6, теперь рисунок 5). Мы также показываем, что воссозданная система только из двух компонентов, Aurora и фосфатазы, демонстрирует одинаковое поведение (бистабильность и гистерезис) in vitro в аналогичном диапазоне концентраций Aurora B.Наша логика проста в том, что бистабильность в клетках может отражать внутреннее свойство киназы Aurora B, которому противостоит некоторая клеточная фосфатаза (ы). Эта гипотеза не только наиболее прямолинейна, но и выдвинута в отсутствие какой-либо другой модели, которая могла бы объяснить бистабильность и гистерезис, наблюдаемые в клетках. Действительно, эти нелинейные фенотипы строго подразумевают, что лежащие в основе молекулярные реакции также бистабильны. Авторы обзора предположили, что причиной могут быть изменения в локализации киназы или фосфатазы при различной концентрации ZM447439.Наши эксперименты, однако, не обнаружили никаких изменений в локализации этих компонентов (новый рисунок 5 — рисунок в приложении 1, см. Также критическую точку 9d). Дополнительная гипотеза, предложенная авторами обзора, заключалась в том, что бистабильность в клетках может быть связана со специфической зависимостью между концентрацией ZM447439 и активностью киназы Aurora, но мы утверждаем, что это также не может объяснить наши клеточные результаты (см. Критическую точку 9e). Наконец, наша недавно добавленная количественная оценка распространения волн активности Aurora B после вымывания ZM447439 показывает, что оно характеризуется постоянной скоростью, отличительной чертой бистабильных систем, которую мы теперь задокументировали в физиологическом контексте (т.е., в живых клетках) (новый рисунок 7).

Более того, даже если бистабильность может формироваться в определенном контексте, далеко не ясно, действительно ли это объясняет или поддерживает пространственную регуляцию Aurora B-зависимого фосфорилирования.

б) Мы предложили эту идею, основываясь на общих знаниях о пространственном поведении бистабильных систем (Лир, Диссипативные решения в реакционно-диффузионных системах, 2013, Springer) и на нашем предварительном моделировании. Теперь мы построили механистическую молекулярную модель пространственной регуляции активности Aurora B в клетке, включающую ферментативные константы, которые мы измерили для аутоактивации Aurora B in vitro (см. Новые разделы в основном тексте).Новые эксперименты были проведены для сбора некоторых недостающих значений параметров для этой модели (распределение полярного сияния B по плечам хромосом на новом рисунке 6 — приложение к рисунку 1, панели B, C). Во-первых, мы демонстрируем, что эта модель количественно согласуется с биостойкостью и гистерезисом, наблюдаемыми в экспериментах на клетках с различными концентрациями ZM447439 (новый рисунок 6C). Во-вторых, мы смоделировали два пространственных явления: распространение фосфорилирования Aurora B вдоль плеч хромосом и распределение активной киназы Aurora B на кинетохоре в прометафазе и метафазе.Затем мы измерили скорость распространения фосфорилирования в живых клетках и обнаружили, что она постоянна (что указывает на бистабильность лежащей в основе молекулярной системы) и количественно согласуется с предсказанием модели (рис. 7). Более того, вариант нашей модели, который включал аутоактивацию киназы Aurora B (положительная обратная связь) и противодействие фосфатазе, но не бистабильность в диапазоне физиологических концентраций, не смог описать этот эксперимент. Наконец, наше моделирование распределения активности Aurora B в центромере и кинетохоре ясно демонстрирует, что бистабильность системы, связанной с киназой Aurora B и фосфатазой, необходима для установления крутого градиента активности Aurora B в тех участках, где находятся его связывающие микротрубочки субстраты. расположен (новый рисунок 8 и рисунок 8 — приложение к рисунку 1).Отсутствие количественного объяснения того, как устанавливается градиент с такими свойствами, ранее определялось в этой области как один из основных нерешенных вопросов (Krennand Musacchio, 2015, Front. Oncol). Таким образом, наши результаты представляют собой концептуально новый механизм, который будет изучен и протестирован в будущих исследованиях.

3) Аннотация. Главный вывод, изложенный в аннотации, состоит в том, что активность Aurora B на расстоянии зависит как от участков высокой концентрации киназы, так и от бистабильности связанной системы киназа-фосфатаза.«Однако, хотя доказательства достаточности локальной концентрации киназы хорошо поддерживаются, нет никаких экспериментальных доказательств, которые бы аргументировали или противостояли требованию бистабильности в пространственной регуляции активности киназы Aurora B.

Благодаря нашим новым результатам доказательства, подтверждающие это утверждение, стали более убедительными.

4) Рисунок 2. Механизмы аутоактивации киназы были исследованы с использованием хемосенсорной системы, и полученные данные очень полезны для определения механизма аутофосфорилирования киназы.Однако, несмотря на то, что было показано, что по крайней мере два (а возможно, больше) фосфорилирования конструкции aurora-INbox (Sessa et al., 2005, Mol Cell, 18, 379) необходимы для полной активации, авторы сравнивают два механизма аутофосфорилирование (рис. 2B, C), оба из которых представляют собой отдельные события фосфорилирования. Кроме того, возможно, что два сайта фосфорилируются по разным механизмам. Действительно, структурное исследование Sessa et al. предположили, что фосфорилирование INCENP по мотиву TSS, которое усиливает активность Aurora B, д. опосредоваться транс-механизмом.Поскольку используемый здесь k _cat измеряется с помощью полностью активированной формы Aurora B-Inbox (Рисунок 3 — рисунок в дополнении 1C и Таблица 2), неясно, насколько полностью активированный A * может быть достигнут с помощью чисто в цис модель, как на рисунке 2B. Таким образом, выводы, сделанные на основе анализа кривых фосфорилирования, являются неполными и требуют дальнейшего моделирования. Дополнительные эксперименты с использованием мутантов сайта фосфорилирования помогли бы решить эту проблему. Кроме того, необходимо проследить кинетику фосфорилирования Aurora B и фосфорилирования INbox (возможно, с помощью геля phostag).

а) Эксперименты с различными мутантами фосфозита помогли бы прояснить точную роль различных сайтов фосфорилирования, но, поскольку это не является основным моментом нашей статьи, мы последовали предложению рецензентов, чтобы улучшить наш анализ в вычислительном отношении. В предыдущей версии рукописи мы использовали данные старого рисунка 2, чтобы выделить два важных момента.

Во-первых, мы предложили ранее упущенный из виду компонент cis в автоактивации Aurora B. Это открытие важно, потому что, как мы показываем в новой рукописи, слабый компонент цис обеспечивает бистабильность в физиологическом диапазоне концентраций Aurora B. Чтобы ответить на критику, что этот вывод требует дополнительного анализа, мы теперь подтвердили механизм автоактивации cis , используя альтернативный подход, предложенный обозревателями (см. Критическую точку 4c), вместо использования подгонки с уравнением на старом рисунке 2B.

Во-вторых, мы ранее использовали это уравнение для оценки ферментативных параметров аутоактивации цис Aurora B. В текущей рукописи мы достигаем этой цели другим подходом: используя глобальную подгонку к данным в новых панелях A и D на Рисунке 2 (см. Раздел Определение параметров автоактивации Aurora B в Материалах и методах).Этот новый подход привел к немного разным оценкам констант, но все основные выводы нашего исследования остаются в силе. Также обратите внимание, что из-за жестких ограничений по времени для повторной отправки мы не смогли синтезировать достаточное количество пользовательского sox-сенсора, который мы использовали в предыдущей версии рукописи. Все эксперименты, представленные на новом рисунке 2, были повторены с коммерческим датчиком Omnia, который фосфорилирован с разными константами относительно нашего собственного хемосенсора. Все эти технические детали описаны в разделах II и III материалов и методов, а все константы перечислены в обновленной таблице 2.

Наконец, мы согласны с тем, что наш подход к моделированию был упрощен с учетом единственного сайта фосфорилирования. Чтобы удовлетворить эту критику, мы построили и проанализировали модель, которая включает два сайта для активации Aurora B (новый раздел «Методы» Модель автоактивации Aurora B через два сайта фосфорилирования, Таблица 3 и Рисунок 2 — Рисунок 2 — Приложение 3). Как и ожидалось, мы можем подогнать все экспериментальные данные с помощью модели двух сайтов. Важно отметить, что эти новые результаты оправдывают использование нами упрощенной модели только с одним сайтом фосфорилирования, так как модель с одним сайтом может быть интерпретирована как модель с двумя сайтами с быстро преобразующейся формой Aurora B с одним фосфорилированным сайтом.

Это важно, поскольку «дефосфорилированная киназа Aurora B была на два порядка менее активна, чем фосфорилированная Aurora B», но эта частично активная Aurora B, по-видимому, содержит значительное количество фосфорилированного INCENP (Рисунок 2 — рисунок в приложении 1C).

b) Старый рисунок 2 — приложение к рисунку 1C не показывает то, что мы назвали «частично активным сиянием B»; ранее мы допустили ошибку, цитируя эту цифру в этом контексте. Вместо этого это контроль для старых рисунков 2 и 3, где аутоактивация Aurora B была исследована в присутствии <100 нМ фосфатазы и 10 мМ ингибитора фосфатазы.Рисунок был включен, чтобы показать, что эта концентрация ингибитора достаточна для полного блокирования активности фосфатазы в отношении INbox. Чтобы облегчить беспокойство рецензентов, мы добавили новый рисунок 2 - приложение к рисунку 1D, на котором показано, что папка «Входящие», связанная с частично активным сиянием Aurora B, полностью нефосфорилирована.

Обе модели предсказывают, что показания датчика пропорциональны t2, и единственной отличительной чертой между тремя моделями является только коэффициент t2.Таким образом, было бы более полезно подобрать каждую кривую независимо к y = k (A) t2, а затем построить график зависимости log (k (A)) от A. График log (k (A)) от A должен быть прямым. линия с наклоном один для механизма активации цис и два для механизма трансактивации. График также может указывать на частичный наклон, что указывает на то, что оба механизма работают, и, кроме того, указывает на важность каждого из механизмов. Чтобы различать эти модели, требуются дополнительные данные с использованием различной концентрации Aurora B.Этот подход также позволит избежать осложнений, связанных с использованием параметра, полученного при полной активации киназы (K _M и V _max из рисунка 3 — рисунок в приложении 1C).

c) Рецензенты, вероятно, подразумевают, что log (k (A)) следует построить в зависимости от logA (а не от A), чтобы получить прямую линию с наклоном 1 для цис -активации и 2 для транс . -Механизм активации. Во-первых, мы получили новые экспериментальные кривые для более широкого диапазона концентраций Aurora B (0.16 — 1,5 мкМ), как было предложено рецензентами. Во-вторых, эти кривые были проанализированы с использованием предложенного подхода, и наш вывод не изменился. Действительно, новая фигура 2C показывает линию со значением наклона 1,23 ± 0,02, которая демонстрирует, что активация цис доминирует над активацией транс во время начальной активации при низкой концентрации киназы. Кроме того, теперь мы наносим на график рассчитанную фракцию киназы Aurora B, фосфорилированной в цис-форме, по сравнению с транс-, и полученные концентрации продукта (см. Новый рисунок 2 — рисунок в приложении 2, панели H и I), так что наша точка зрения более ясна.

Кроме того, на характер кривых может влиять линейность хемосенсора. Хотя из раздела «Методы» можно сделать вывод, что стандартные кривые для датчика являются линейными, диапазон линейности не упоминается и, возможно, имеет решающее значение для подбора начальных стадий фосфорилирования на рис. 2B, C и D.

d) Обычно флуоресценция линейна по отношению к концентрации красителя в очень большом диапазоне концентраций (до 100 мМ). Калибровочные кривые для двух хемосенсоров теперь представлены для диапазона концентраций, использованного в нашем исследовании (новый рисунок 2 — приложение к рисунку 2C).

5) Модели, используемые для соответствия данным, показанным на рисунках 2 и 3 — приложение к рисунку 1E, не упоминаются ни в тексте, ни в легенде рисунка, а из раздела «Материалы и методы» (подраздел «Теоретическое моделирование») , данные, похоже, были подогнаны уравнением 2 или уравнением 1.

a) Сожалеем, что эта информация была недостаточно видна. Стратегия подгонки в новой версии рукописи была упрощена; количество фигур для анализа in vitro уменьшено.Все детали установки описаны в значительно улучшенном виде в Материалах и методах.

Дифференциальные уравнения как в наборе уравнений 1, так и в наборе уравнений 2 содержат процессы двух совершенно разных временных масштабов. Связывание субстрата с ферментом обычно составляет порядка миллисекунд, а ферментативная активность в этом случае составляет порядка минут. Использование этих двух шкал времени в одном моделировании ODE обязательно приведет к очень нестабильным результатам. Например, значение k _f из таблицы 2 равно 0. 38 мкМ-1 с-1 на порядки меньше, чем обычные константы связывания субстрата, полученные с помощью спектрофотометрии с остановленным потоком (например, Bowman et al. 1992, J. Biol. Chem, 267, 5346). Неправильная оценка повлияет на прогнозы всех других систем, смоделированных с использованием этих параметров. Поскольку концентрации субстрата намного выше, чем концентрации фермента (10 нМ фермента по сравнению с датчиком 7,5 мкМ), приближение квазистационарного состояния может применяться к связыванию субстрата (Segel & Slemrod 1989, SIAM Review, 31, 446; Rao & Arkin 2003, Дж.Chem. Phys, 118, 4999), чтобы избежать моделирования в совершенно разных временных масштабах и значительно упростить процесс. Это означало бы, что концентрация [SA *] постоянна во времени. Это допущение уменьшит три переменные k _f , k _r и k _cat до двух переменных K _M и k _cat и сведет три дифференциальных уравнения к одному аналитическому выражению в уравнении 1.

б) Действительно, наборы уравнений 1 и 2 описывают процессы в различных временных масштабах; однако мы считаем, что наш алгоритм расчета правильно решает эту проблему.Чтобы продемонстрировать правильность полученных численных решений, мы пересчитали эти наборы уравнений с уменьшенным шагом по времени. В частности, мы подтвердили, что расчеты с шагом 0,02 с дали разницу менее 10-6 мкМ по сравнению с расчетами с шагом 2 × 10-4 с). Кроме того, мы применили приближение квазистационарного состояния, как было предложено рецензентами, для описания данных на новых рисунках 2A, D и получили те же результаты, что и с нашей схемой расчета.

Вышеизложенные опасения в определенной степени справедливы и для аутофосфорилирования ферментов.Но приближение квазистационарного состояния неприменимо для аутофосфорилирования ферментов, и могут потребоваться другие упрощения (Schnell & Maini 2000, Bull. Math. BIol, 62, 483) при подборе данных из рисунков 3B, C и моделировании для Рисунки 4, Рисунок 4 — дополнение к рисунку 1 и Рисунок 5.

c) Мы согласны с тем, что приближение квазистационарного состояния не может быть использовано для анализа различных схем автоактивации киназы без субстрата, поскольку разные схемы требуют разных упрощений.Чтобы избежать этого усложнения, мы использовали сложный численный подход (см. Раздел V «Материалы и методы»), который решает все наборы уравнений в нашей статье единым и последовательным образом.

6) Данные на рисунке 3C (серые точки) выглядят как стандартный сигмовидный сигнал, который насыщается при концентрации активной киназы 2 мкМ. Этого явно следовало ожидать, поскольку общая добавленная киназа составляла 4 мкМ. Используемая здесь модель не учитывает тот факт, что активация киназы достигает частичного насыщения (т.е.е. концентрация активированной киназы сопоставима с неактивной киназой). Если это исправить, используя простой баланс для общего количества добавленной киназы, ясно, что модель будет предсказывать насыщение активированной киназы, как показано на рисунке 3C.

Мы думаем, что рецензенты согласятся, что экспериментальные данные на предыдущем рисунке 3C были зашумленными, и измерения остановились до того, как можно было убедительно наблюдать плато. Этот эксперимент технически сложен, потому что 1) для сохранения реагентов начальная реакция составляет всего 8-16 мкл в объеме и 1-2 мкл образцов берутся в разное время для определения активности киназы, и 2) реакция и отбор образцов происходят в диализе. трубки, чтобы избежать истощения АТФ и возможного ингибирования АДФ.Мы улучшили нашу технику и повторили этот эксперимент более точно с большей статистикой и более длительным временем инкубации. Улучшенный график (новый рисунок 2D) показывает насыщение при максимальной концентрации.

7) Рисунок 4. Авторы моделируют связанную систему киназа-фосфатаза, используя полученные данные автофосфорилирования, и показывают, что система приводит к возможному бистабильному поведению (Рисунок 4B). Однако используемые здесь модели не учитывают насыщение активации киназы (рис. 3B, C).Это изменило бы параметры, используемые для соответствия моделям, и, таким образом, изменило бы границы и положение бистабильной области на графике бифуркации (рис. 4B) и количественные прогнозы на рис. 4C, D и E и рис. 4 — дополнение к рисунку 1A, B и С.

a) Этот вопрос решен в существенном пункте 6 (выше). Эксперимент был повторен, чтобы показать отсутствие частичного насыщения (новый рисунок 2D).

Даже если корректировки, необходимые для кривых гистерезиса, не изменяют существенно бифуркационный график на рисунке 4B, авторы показали, что бистабильное поведение происходит при концентрациях киназы, значительно превышающих физиологические концентрации (4 мкМ по сравнению с 10 нМ) и в очень узком диапазоне концентраций фосфатазы (0.От 2 мкМ до 0,6 мкМ PPase). Чтобы объяснить градиенты при физиологической концентрации с использованием бистабильности, предложенной авторами, концентрация киназы по всему градиенту должна находиться в бистабильной области, то есть более 4 мкМ. Даже если возможно, что локальная концентрация в центромере и средней зоне анафазного веретена может быть достаточно высокой, маловероятно, что оставшейся киназы будет достаточно для поддержания таких высоких концентраций во всем градиенте, особенно в анафазе.Авторы могут утверждать, что Aurora B быстро инактивируется после выхода из режима бистабильности, но если это так, значение бистабильности (или истерического поведения) системы Aurora B-фосфатазы в модели реакции-диффузии не очевидно. Чтобы в достаточной мере продемонстрировать значимость бистабильного поведения, авторам необходимо решить эту проблему.

b) 10 нМ — расчетная концентрация растворимого Aurora B (Mahen et al., 2014, MBoC), в то время как расчетная концентрация киназы, связанной с центромерами, значительно выше (новый рисунок 6 — приложение к рисунку 1D, E).Этот диапазон аналогичен тому, что мы используем в наших экспериментах in vitro. Мы объясняем, как был создан профиль концентрации на этом рисунке, в разделе IV «Материалы и методы». Важно отметить, что киназа Aurora B связана с хроматином через удлиненный INCENP (Samejima et al., 2015, JBC), поэтому одна молекула киназы может достигать других молекул, расположенных на расстоянии 30 нм или дальше. Таким образом, связанная киназа, вероятно, будет способна активироваться в транс в зависимости от концентрации. Это становится очень сложной системой, потому что киназа, связанная с хроматином, также находится в динамическом равновесии с пулом растворимых веществ.Согласно нашим расчетам, киназа, связанная с хроматином, становится полностью активной (в состоянии on) по всему центромерному хроматину в прометафазе. В метафазе, когда центромера растягивается и локальная плотность киназ снижается, модель предсказывает область с бистабильностью около внешней области кинетохоры, где предсказывается крутой градиент активности (новый рисунок 8 — приложение к рисунку 1C, E). Мы демонстрируем важность бистабильного поведения, рассматривая модель с модифицированной киназой Aurora B, в которой бистабильность наблюдается при концентрациях, превышающих те, которые обнаруживаются на центромере (новый рисунок 6D). Эта модель также предсказывает градиент активности киназы Aurora B, который просто отражает распределение ее сайтов связывания (новый рисунок 8 — приложение к рисунку 1B, D, F). Важно отметить, что градиент в модели без бистабильности лишен крутой области, совпадающей с внешней кинетохорой. Более того, этот градиент не изменяется значительно в ответ на растяжение кинетохор в метафазе, тогда как бистабильная модель показывает ожидаемую потерю фосфорилирования на внешней кинетохоре в метафазе.Мы полагаем, что эти новые данные ясно иллюстрируют сущность новой концепции, которую мы предлагаем для пространственной регуляции киназы Aurora B, в которой бистабильность играет существенную роль.

8) Возможный гистерезис, показанный на рисунке 5C, является интересными данными, но кривая инактивации (рисунок 5C — красные точки) показывает незначительную нелинейность, которая вызывает беспокойство, поскольку прогнозы модели (рисунок 5C — сплошная красная линия) явно неверны. -линейный. Это ставит под сомнение бистабильность системы in vitro.

Мы добавили новые точки данных к этой кривой (новый рисунок 4C), и нелинейное поведение экспериментальных данных теперь более очевидно. Мы отмечаем, что эти эксперименты трудоемки, с большинством точек данных, представляющих по крайней мере 2 повтора кинетических кривых, как на новом рисунке 4B; что важно, они потребляют большое количество киназы и других реагентов. Эти ограничения не позволяют нам включать дополнительные измерения на этой уже четко определенной кривой.

9) Данные in vivo, показанные на рисунке 6, могут отражать наиболее интересное гистерезисное поведение в статье.Из данных на рисунке 6A, единственная надежная концентрация в бистабильной области, кажется, составляет 0,75 мкМ, но данные на рисунке 6B, кажется, расширяют бистабильную область с 0,5 до 1 мкМ. Это можно исправить, если вместо построения средних значений гистограмм будет построено среднее значение для каждой отдельной клетки при каждой концентрации ингибитора, как показано на Рисунке 2B Ozbudak et al. (2004, Nature, 427, 737).

а) Спасибо за это предложение. Данные были перестроены и теперь показаны на новом рисунке 5B.

Представляют ли верхние панели датчик на Рисунке 6A? Если да, то почему интенсивность двух изображений существенно различается? Какая связь между интенсивностью датчика и соотношением FRET?

b) Верхние панели представляют собой изображения CFP, показывающие локализацию датчика, с более высокой интенсивностью, указывающей на более высокий уровень экспрессии датчика. Эта проблема возникла в нашей предыдущей работе и публикациях с этим датчиком, и мы ранее анализировали клетки с диапазоном уровней экспрессии, чтобы обнаружить, что соотношение FRET не зависит от уровня экспрессии (не показано).Чтобы сделать результат более ясным, мы выбрали ячейки с аналогичными уровнями экспрессии для этого рисунка (новый рисунок 5A).

Поскольку данные на Рисунке 6D выглядят достаточно убедительно, также может быть полезно увеличить количество промежуточных точек концентрации, чтобы прочно установить бистабильную область in vivo.

c) Наше основное внимание во время этого повторного представления было сосредоточено на изучении важности бистабильности для пространственной регуляции передачи сигналов киназ, но мы также добавили дополнительные данные к этому графику, что хорошо согласуется с предсказаниями нашей новой модели (новый рисунок 5D и 6С).

Даже если авторы обратятся к вышеперечисленным пунктам, останутся два важных замечания. 1) Хорошо известно, что локализация Aurora B в центромере нарушается ингибированием киназы Aurora B. Если количество киназы центромеры изменяется, трудно утверждать, что это бистабильность, поскольку ингибирование киназы влияет не только на активность киназы, но и на локальную концентрацию самой киназы. Более того, PP1 на кинетохоре может регулироваться Aurora B, как показано лабораторией Лэмпсона.Таким образом, этот процесс намного сложнее, чем обсуждается здесь.

d) Мы отмечаем, что одна из оригинальных статей, в которых сообщалось о химическом ингибировании Aurora B, показала, что киназа обычно локализуется в присутствии ингибитора (Ditchfield et al. 2003, JCB, рис. 6). В соответствии с этим результатом, мы теперь показываем, что локализация киназы не изменяется в нашем эксперименте (новый рисунок 5 — рисунок в приложении 1). Кроме того, PP1 не локализуется в кинетохорах в присутствии нокодазола (Liu et al., 2010 JCB), именно так и проводились наши эксперименты, показывающие гистерезис in vivo, и мы не обнаруживаем никаких изменений в локализации PP1 в присутствии ZM447439 (новый рисунок 5 — приложение к рисунку 1B).

2) В соответствии с точкой 1 не очевидно, является ли концентрация ингибитора и активность киназы линейной. В противном случае доказать бистабильность очень сложно. Чтобы исследовать этот момент, было бы критически важно измерить локальную концентрацию активного Aurora B (возможно, используя антифосфо-Aurora B) в широком диапазоне концентраций ингибитора Aurora B.

e) Это хороший момент, и взаимосвязь ингибитор-киназа уже опубликована (Ditchfield et al. 2003, JCB). В этой работе авторы сообщают об аналогичном IC50 для ингибирования ZM447439 Aurora A и Aurora B, и было обнаружено, что активность киназы Aurora A по сравнению с концентрацией ZM447439 представляет собой показатель степени. Мы использовали эту зависимость в нашей недавно разработанной теоретической модели (описанной в разделе «Материалы и методы»), и модель предсказывает бистабильность. Важно отметить, что вариант этой модели, в которой использовалось то же отношение ингибитор-киназа, но другое k _цис для Aurora B, не предсказал области бистабильности для физиологической концентрации киназы Aurora B (новый рисунок 6D), подразумевая, что бистабильность не является вызвано этим отношением ингибитор-киназа.Только модель с бистабильностью обеспечила хорошее согласие с результатами экспериментов in vivo (новый рисунок 6C, рисунок 7).

Эти вопросы можно решить, направив Aurora B-INbox на центромеру, но даже в этом случае все еще не ясно, помогает ли бистабильное (или гистерезисное) поведение системы B-фосфатазы Aurora объяснить, как фосфорилирование кинетохор контролируется микротрубочками. статус вложения.

f) Теперь мы предоставляем новые доказательства важности бистабильности в пространственной регуляции активности полярного сияния B (новый рисунок 8, рисунок 8 — приложение к рисунку 1 и соответствующий текст). Однозначно продемонстрировать, что этот механизм работает в клетках, чтобы контролировать статус прикрепления микротрубочек, является долгосрочной целью, выходящей за рамки данной статьи. Поскольку планка для объяснения пространственной регуляции Aurora B в клетках, одного из самых загадочных и плохо изученных аспектов митоза, очень высока, наша повторно представленная работа не сможет полностью ответить на такую ​​критику. Однако мы считаем, что наша работа действительно представляет собой большой шаг вперед в решении этой важной проблемы.По аналогии, пространственные градиенты активности полярного сияния B в анафазе были впервые описаны Лэмпсоном и его коллегами (Fuller et al., 2008, Nature) за годы до того, как было обнаружено функциональное значение таких градиентов (Uehara et al.2013, JCB; Ferreira et al. 2013, JCB; Афонсо и др., 2014, Science). Мы надеемся, что вы примете во внимание нашу измененную рукопись без исчерпывающего объяснения пространственной регуляции Aurora B in vivo. Важно отметить, что наша теоретическая модель, основанная на бистабильности системы киназа Aurora B-фосфатаза, действительно обеспечивает единое объяснение наших объединенных данных как in vitro, так и in vivo.Мы не смогли сформулировать альтернативную гипотезу, которая объединила бы все наши данные и ранее опубликованные результаты о локализации и регуляции Aurora B. Таким образом, мы полагаем, что наши текущие результаты представляют собой большой шаг вперед к долгосрочной цели понимания того, как контролируются прикрепления микротрубочек.

10) Относительно теоретического моделирования рисунка 2 (подраздел «Теоретическое моделирование»). Во-первых, авторы должны четко заявить, что при выводе уравнения для P (t) на Рисунке 2B они предполагают, что A * (0) = 0 (A * (t) = активная форма киназы Aurora B) и существует очень малая чистая конверсия неактивного A в A * в течение 15 мин эксперимента.2, как в уравнении на рисунке 2B. Хорошо, но тогда авторы должны проверить предположение, которое они сделали при выводе уравнения. Для kcat_trans = 0,0004 / с / мкМ и A (0) = 0,1 мкМ (желтые данные на рисунке 2) я получаю dA * / dt = 0,004 нМ / с. В течение 16 минут (1000 с) A * увеличится с 0 до 4 нМ, а A уменьшится со 100 до 92 нМ. Следовательно, предположение, что очень мало A превращается в A * в ходе эксперимента, вероятно, в порядке.

Мы согласны с рецензентами, что для вывода уравнений для P (t) на предыдущем рисунке 2B мы предположили, что в течение первых 15 минут было очень небольшое чистое преобразование частично активного A в A *.Теперь мы изменили нашу стратегию анализа этих данных (текущий рисунок 2 — рисунок в приложении 2G), поэтому это предположение больше не является существенным. Мы также отмечаем, что мы непосредственно подсчитали, что в этих экспериментах происходит полное фосфорилирование субстрата, в то время как активная киназа составляет менее 2% от общего количества, так что конверсия действительно очень мала (Рисунок 2 — рисунок в приложении 2 панели H и I).

11) Однако более тревожным является следующий предварительный расчет P (t) с использованием данных на рисунке 2. 2. Следовательно, P (5 мин) = 0,55 мкМ и P (10 мин) = 2,2 мкМ. Эти числа не соответствуют черной кривой, проведенной через желтые данные. Мои цифры отклонены примерно в два раза, но я не могу найти недостающий множитель 2.

Этот расчет не учитывает фактор 2 в уравнении для P (t) (предыдущий рисунок 2B, C и новый рисунок 2 — приложение к рисунку 2G). Учет этого фактора дает хорошее совпадение с экспериментальными данными:

K _cat S / ( K _M + S) = 2.2

P (5 мин) = 0,4 мкМ

P (10 мин) = 1,6 мкМ

Обратите внимание, что в ответ на другие критические комментарии эти экспериментальные данные были изменены, и мы больше не используем графики и уравнения, как на предыдущем рисунке 2B, C для получения ферментативных констант.

12) Существует еще одно численное расхождение между рисунком 5 и рис. 4 — дополнение к рисунку 1. Расчетная кривая на рис. 4 — дополнение к рисунку 1 показывает, что AurB распадается до своей стационарной активности через ~ 3 часа, но измеренная кривая ( Рисунок 5) переходит в установившееся состояние намного быстрее (~ 1 час).

Нет расхождений между предыдущими рисунками 5 и рисунками 4 — добавление к рисунку 1. Константы скорости спада активности полярного сияния B составляют 0,02 мин. _-1 для старого рисунка 5B в середине и 0,022 мин-1 для старого рисунка 4 — приложение к рисунку 1A . Это небольшое различие связано с разными концентрациями фосфатазы (0,35 мкМ против 0,4 мкМ).

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные исправления, как описано ниже.]

Мы будем рады принять ваше исследование, если вы включите краткое предупреждение о том, что вы использовали нефизиологическую фосфатазу в своей модельной системе […]

В ответ на ваше предложение «включить краткое предупреждение о том, что вы использовали нефизиологическую фосфатазу в своей модельной системе», мы добавили текст на:

1) Четко укажите, что λ фаговая фосфатаза использовалась в нашей упрощенной системе восстановления in vitro (подраздел «Бистабильность киназы-фосфатазы Aurora B и гистерезис, наблюдаемые in vitro, количественно согласуются с теоретическим предсказанием»).

2) Подчеркните, что эта фосфатаза не является физиологической в ​​Обсуждении. Соответствующий раздел цитируется ниже:

«Важно отметить, что наш теоретический анализ предсказал, что бистабильность сильно зависит от механизма аутоактивации киназы Aurora B, в то время как кинетические константы для реакции дефосфорилирования имеют гораздо меньшее влияние (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1). Таким образом, хотя в нашем упрощенном восстановлении in vitro использовалась нефизиологическая λ-фосфатаза, модель предполагала, что эти нелинейные режимы могут существовать в физиологическом клеточном контексте, где киназа Aurora B связана со своим партнером (партнерами) нативной фосфатазой.Действительно, нам удалось воссоздать бистабильность и гистерезис фосфорилирования субстрата Aurora B в живых митотических клетках… »

[…] И вы обсуждаете, как характеристики системы могут измениться in vivo, учитывая доказательства того, что активность фосфатазы пространственно регулируется in vivo.

В ответ на ваше предложение «обсудить, как характеристики системы могут измениться in vivo с учетом доказательств того, что активность фосфатазы пространственно регулируется in vivo», мы расширили последний абзац раздела «Обсуждение», включив в него:

«В дополнение к бистабильной системе, описанной здесь, другие механизмы могут также регулировать пространственные паттерны активности Aurora B, такие как изменения в обогащении Aurora B на центромерах по мере выравнивания хромосом (Salimian et al., 2011) и локализованная активность фосфатазы в различных клеточных участках, таких как кинетохоры, центромеры или хроматин (Trinkle-Mulcahy et al., 2003; Kitajima et al., 2006; Riedel et al., 2006; Tang et al., 2006). ; Trinkle-Mulcahy et al., 2006; Liu et al., 2010; Foley et al., 2011). Локализация PP1 и PP2A на кинетохорах зависит от прикрепления и натяжения микротрубочек, и изменения в этих локальных активностях фосфатазы могут модулировать расположение бистабильной области активности Aurora B или оказывать прямое влияние на субстраты, которые расположены в непосредственной близости. ”

Алексей Зайцев, автор блогов Cisco

Блоги Cisco / Алексей Зайцев

Менеджер по продукту, маркетинг

CPM: сертифицированный менеджер по продукту (AIPMM),

MBA: магистр делового администрирования (Университет Уэльса / Великобритания).

С большим интересом к разработке и маркетингу новых продуктов!

Более 15 лет опыта в области управления продуктами, продуктового маркетинга, технического маркетинга и продаж.

Опыт работы в следующих сегментах: поставщики, поставщики услуг, предприятия и системные интеграторы / партнеры, включая США, ЕС и развивающиеся рынки.

Управляемая разработка продуктов и маркетинг продуктов в областях конвергентного доступа, коммутируемого доступа, WiFi и WiMAX.

Управлял проектами продаж в областях Wi-Fi, WiMAX, 3G, LTE, фиксированной широкополосной связи и конвергенции фиксированной и мобильной связи во всех отраслях промышленности. Опыт включает в себя проекты поставщиков услуг Wi-Fi с интеграцией между сетью Wi-Fi и Mobile Packet Core.

Проповедник системных решений: унифицированный доступ, BYOD, Cisco Connected Mobile Experience, Hotspot 2.0 и т. Д.

Управляемая разработка сложных кросс-вертикальных решений с проверенной историей успеха.

Глубокие знания в области маркетинга мобильных приложений и мобильных услуг.

Опыт работы включает в себя как крупные, средние компании, так и стартапы.

Статьи

теперь доступен на Catalyst 4500E!

Catalyst 4500E Supervisor 8-E теперь поддерживает конвергентный доступ с IOS XE 3.7 выпуск. Supervisor 8-E — это высокопроизводительный супервизор последнего поколения для Catalyst4500E, обеспечивающий передовые функции, такие как Service Discovery Gateway и поддержку SDN Openflow в дополнение к конвергентному доступу и лучшим в отрасли масштабированию и производительности. Miercom недавно протестировал […]

повышает производительность беспроводной связи в школе Южного острова, Гонконг

Школа Южного острова в Гонконге состоит из студентов со всего мира, а также 1400 студентов из более чем 35 стран.Одной ценностью, которая отличает школу от других, является ее приверженность использованию технологий в классе. Например, у каждого студента есть ноутбук, который он использует для доступа к электронным книгам, просмотра обучающих видео и […]

Константин Зайцев, один из пяти лучших молодых российских ученых в области системной биологии, по системной биологии в России

Константин Зайцев, сотрудник Международной лаборатории компьютерных технологий Университета ИТМО, недавно стал победителем программы Skoltech Fellowship Program 2019 и вошел в пятерку молодых российских ученых в области системной биологии.Церемония награждения состоялась вчера в Москве. В последние годы исследователь сосредоточил свои усилия на разработке методов анализа данных об активности генов, позволяющих идентифицировать маркеры транскрипции типов клеток в смешанных выборках. В интервью ITMO.NEWS Константин рассказал о своей работе и исследованиях, опубликованных в Nature Communications, а также о том, как стал успешным системным биологом и почему это возможно в современной России.

Буквально вчера были объявлены победители программы Skoltech Fellowship Program 2019.Вы вошли в топ-5 молодых ученых в области системной биологии с проектом, посвященным секвенированию одноклеточной РНК. Расскажите подробнее о своей работе.

Я начну работать над этим проектом только в рамках программы. Тем не менее у меня уже есть определенное количество проектов в этой сфере. Цель этого — выявить источники вариации данных секвенирования РНК отдельных клеток.

На протяжении десятилетий мы получали РНК из образца (например, крови) и изучали его в целом, но теперь мы можем сделать даже лучше.Мы можем взять образец, который представляет собой раствор клеток, и определить РНК, присутствующую в каждой конкретной клетке. Это может помочь нам понять, что происходит в каждом из них.

Допустим, у вас есть группа больных и контрольная группа, и вы сравниваете их РНК. Вы берете образцы крови у каждого человека, но у некоторых в крови может быть больше лимфоцитов, а у некоторых — меньше. Видите ли, каждый образец имеет очень сложный клеточный состав.

Теперь мы можем взять образец и сразу же разделить его на клеточные компоненты.Это означает, что мы можем сразу узнать количество лимфоцитов и их экспрессию генов, количество моноцитов и их РНК и так далее. С точки зрения биологии, это все равно отбор проб, но он позволяет нам достичь более высокого уровня анализа и лучше понять, что происходит с образцом.

Это чрезвычайно интересно, но есть определенные проблемы. Фактически, вся РНК, которая существует в клетке, на самом деле является РНК, которая определяется типом клетки и конкретными процессами, происходящими в этой клетке, такими как деление или ответ на какой-либо внешний стимулятор. Мы хотим иметь возможность понимать сразу несколько вещей: и тип клетки, и какие процессы в ней активизировались. Это то, о чем мое исследование.

Как давно ученые сосредоточились на таких задачах?

На сегодняшний день секвенирование отдельных клеток — это передовая системная биология. Только в последние годы ученые поняли, как эффективно изолировать клетки с целью секвенирования РНК, и, что более важно, как делать это с тысячами клеток одновременно.Более того, теперь мы можем заниматься такими вещами, как изучение не только РНК, но и белков, существующих на поверхности клетки. Другими словами, мы можем изучить все сразу.

Константин Зайцев на Летней школе по биоинформатике. Предоставлено: bioinformaticsinstitute.ru

Как бы вы объяснили важность изучения РНК одиночных клеток с точки зрения непрофессионала?

Различные клетки имеют разные функции клеток. Проще говоря, могу привести следующую аналогию: у вас есть пачка Skittles с конфетами разного цвета. Если вы съедите горсть сразу, вы почувствуете вкус каждого из них. Вы будете знать, что едите кегли, но не сможете сказать, какого они цвета, или почувствовать вкус каждой конкретной конфеты. Итак, секвенирование РНК отдельной клетки похоже на то, как мы берем пачку, разделяем ее содержимое на разные группы по цвету (в нашем случае — компоненты) и пытаемся понять конкретные клеточные процессы, которые были активированы в этих клетках.

С одной стороны, нас интересуют процессы, а с другой — мы хотим точно знать, сколько ячеек у нас есть.Если это опухоль, которую мы изучаем, в ней есть как злокачественные, так и иммунные клетки, и мы хотим знать, что эти иммунные клетки там делают, сколько их и сколько других клеток делают что-то полезное. Если вы возьмете кусочек образца и проанализируете всю его РНК, вы получите средний результат, а мы хотим узнать обо всех ключевых игроках и о том, как они действуют.

Когда и как вы пришли к идее вашего проекта?

Я работал с этой технологией несколько лет и понял, что в этой области есть проблемы, которые разные люди научились решать разными способами.

С одной стороны, в таких условиях, когда у вас большое количество клеток, вы начинаете анализировать данные и пытаетесь понять, какие типы клеток у вас есть (например, Т-клетки, В-клетки, моноциты и т. Д.). С другой стороны, у вас есть сигнал деления. Дело в том, что сигнал изменяет клетки до такой степени, что делящиеся клетки становятся более похожими друг на друга, чем на клетки своего типа. В определенном смысле можно сказать, что сигнал полностью «обновляет» ячейку.

Кредит: наука.com

Как я уже сказал, люди научились избегать этого: если они знают, что в их наборе данных присутствует клеточное деление, они избавляются от этого сигнала и анализируют данные при его отсутствии. Но это очень интересные данные, которые нельзя терять. И нам бы очень хотелось, если бы мы могли изучить все клетки, которые есть в выборке, их тип и связанные с ними процессы.

Каковы практические применения секвенирования одноклеточной РНК?

Имеет множество применений; Что касается нас, то мы применяли его при изучении различных заболеваний и их моделей: онкологических заболеваний, вирусных заболеваний, атеросклероза. Если мы говорим об исследовании рака, секвенирование одноклеточной РНК полезно для изучения как злокачественных, так и иммунных клеток, которые проникают в опухоль для борьбы с болезнью. Кроме того, мы можем использовать эту технологию для изучения того, как вирус Зика поражает стволовые клетки костного мозга мышей. В целом, применение секвенирования одноклеточной РНК не ограничивается только областью медицины. Но лично меня интересует именно эта область.

Как вы собираетесь организовать свою исследовательскую работу?

Проект рассчитан на три года, и я надеюсь, что у этого будет достаточно времени для проведения необходимого объема исследований.Большую часть работы я буду делать здесь, в Университете ИТМО. Более того, мы также сотрудничаем с Вашингтонским университетом в Сент-Луисе. Итак, если мы поймем, что нам нужно создать набор биологических данных для проверки этого метода, это не вызовет особых проблем.

Ваша статья недавно была опубликована в Nature Communications. Связано ли это с подобным полем?

Поле немного отличалось, но задачи имели много общего.В этом исследовании мы изучали РНК смешанных образцов, а не отдельных клеток; в то же время мы сказали, что можем рассматривать образец как комбинацию типов клеток и пытаться предсказать соотношение типов клеток в образцах. В моем текущем исследовании я рассматриваю каждую конкретную клетку как комбинацию типов клеток и клеточных процессов, но я также пытаюсь понять, как разбить ее на компоненты. С математической точки зрения эти задачи очень похожи, поэтому я стремлюсь применить практики из этой исследовательской статьи, чтобы выяснить, как все это работает на клеточном уровне.

Кредит: discovermagazine.com

Вы получили степень бакалавра на факультете компьютерных технологий Университета ИТМО. Почему вы решили не заниматься промышленным программированием, а заинтересовались наукой, а именно системной биологией?

Думаю, что моя главная мотивация — это возможность генерировать новые знания. На самом деле, у меня есть интересная история с биологией. Я закончила лицей по специальности физика и математика, и у меня не было учителя, который бы показал мне, что биология действительно интересная наука.Я считаю, что это обычная черта таких учебных заведений, где основной упор делается на математику. Поэтому в школьные годы химию и биологию не любила.

К концу бакалавриата я начал работать с Алексей Сергушичев (Алексей Сергушичев — научный сотрудник международной лаборатории ИТМО «Компьютерные технологии», руководитель магистерской программы по биоинформатике и системной биологии — Ред.). Моя работа в основном была связана с программированием.Но я уже начал пытаться узнать больше, лучше понять биологию.

Например, я посмотрел отличный видеокурс «Введение в биологию» Эрика Ландера , который меня очень заинтересовал. Затем я пошел в Летнюю школу по биоинформатике, и там было много замечательных лекторов, которые рассказывали об этой науке и своих исследованиях. Я подумал: «Вау. Все отлично ». С тех пор я сосредоточился на этой области.

Эрик Ландер. Кредит: news.mit.edu

Системная биология как общий термин получила широкое распространение в 2000-х годах, что сделало ее молодой областью исследований в контексте развития фундаментальной науки.О чем идет работа в этой сфере?

Для меня системная биология — это что-то вроде инструментария для биологов. Мы ежедневно решаем фундаментальные задачи: биологи приносят нам данные, а мы анализируем их и генерируем новые гипотезы. Затем биологи возвращаются в свои лаборатории и проводят эксперименты, чтобы их подтвердить.

В некотором смысле системная биология похожа на машинное обучение: она наиболее полезна, когда решает конкретные задачи в определенной области.

Во всех междисциплинарных областях всегда актуален вопрос понимания специалистов из других областей.Как решается эта проблема в области системной биологии?

На данный момент я бы сказал, что нахожусь между двумя областями исследований. Так что вы можете сказать, что я выступаю своего рода переводчиком. Но на ранних этапах это был действительно сложный процесс. Первые два года у меня были проблемы с пониманием своих задач: общее представление у меня было, но уловить нюансы было довольно сложно.

Вашингтонский университет в Сент-Луисе, факультет патологии и иммунологии. Кредит: патология.wustl.edu

Мне повезло, что у меня появилась возможность пройти стажировку в США, в Вашингтонском университете в Сент-Луисе, на кафедре патологии и иммунологии. Я провел там свое время, работая в команде, где около семи человек знали, как кодировать. Остальные члены, а это было более 200 человек, были заядлыми иммунологами. Раз в неделю у нас были семинары, на которых аспиранты и аспиранты из различных лабораторий рассказывали о своей работе за 15 минут. Сначала я не мог понять больше, чем первые три слайда любой презентации.Примерно за год я выучил достаточно, чтобы понять первые десять. Сделать первые шаги в системной биологии — непростой процесс, вам нужно много читать и следить за последними исследованиями в этой области.

Говоря об этом, не могли бы вы назвать ключевые компетенции, которыми должен обладать системный биолог?

Без сомнения, вам необходимы фундаментальные знания в области молекулярной биологии и биоинженерии. В настоящее время в нашей работе просто недопустимо ничего не знать о CRISPR.Без этого вы не сможете понять статьи, опубликованные в международных журналах.

В целом нужно идти в ногу с новейшими технологиями. Нельзя сосредоточиться только на одной задаче и ждать, пока она будет решена. Также важно посмотреть, что делается в биологии и смежных областях. Я бы даже сказал, что сегодня вряд ли возможно найти статью в хорошем международном журнале, где все авторы были бы чистыми биологами. Решить задачу в рамках одного направления исследований стало просто невозможно.

CRISPR-Cas9

С другой стороны, у нас есть коллаборации. Вам не нужно слишком углубляться в другую область. Если в команде есть человек, обладающий глубокими познаниями в области биологии, и еще один специалист в области биоинформатики, они наверняка смогут прийти к соглашению и понять друг друга.

В рамках программы стипендий Сколтеха вы будете работать в России следующие три года. В целом, достаточно ли возможностей и перспектив заниматься системной биологией в современной России?

Если мы говорим о биоинформатике и системной биологии, то да, безусловно.В биологических науках ситуация может быть иной: вам нужно будет закупить химикаты и дополнительное оборудование, доставить их и найти дополнительное финансирование для этих расходов. Что касается системной биологии, все, что вам нужно, — это ноутбук, а иногда и компьютерный кластер, и у нас в России таких ресурсов предостаточно. Наконец, вы можете привлекать соавторов и взаимодействовать с ними удаленно.

У нас также достаточно компетенций и специалистов, как в Санкт-Петербурге, так и в Москве, а также в других городах.Например, мы скоро уезжаем на конференцию в Томск; в Казани тоже есть сильные кадры. Более того, мы проводим различные мероприятия, включая семинары, летние школы и т. Д., На которые часто собираются участники со всей страны.

Летняя школа по биоинформатике .. Кредит: bioinformaticsinstitute.ru

Помимо вашей работы в рамках программы стипендий, какие проекты вы планируете реализовать в ближайшем будущем?

Мы хотим изучить большое количество наборов данных секвенирования одноклеточной РНК, включая те, которые связаны с исследованиями рака.Было бы здорово разработать сервис, в котором каждый исследователь, занимающийся этим вопросом, мог бы открыть любой из общедоступных наборов данных и просмотреть данные. На данный момент нет проблем с доступом к общим наборам данных по выражению, но если мы говорим о наборах данных в отдельных ячейках, это не так просто из-за их размера, сложности и особых проблем с визуализацией. С другой стороны, наборы данных секвенирования РНК одиночных клеток предоставляют прекрасную возможность узнать, что экспрессируется, где и в каких тканях, клетках или популяциях клеток может быть активен конкретный ген. Такая услуга может быть полезна исследователям, которые ищут новых потенциальных клиентов.

С. В. Зайцев, “Реализация адаптивных регуляторов в системах управления распределением”, Вестн. Астраханский государственный технический университет. Сер. Менеджмент, компьютерные науки и информатика, 2020, №1. 3, 99–104

Система управления ОЗТОС, ориентированная на соответствие нормативным требованиям, является ключом к безопасной и экологичной деятельности | Международная конференция и выставка SPE по охране труда, окружающей среды и устойчивого развития

Резюме

Компания BP Exploration Caspian Sea (BP Caspian) является оператором ряда крупных проектов в азербайджанском секторе Каспийского и Закавказского региона. Геологоразведочные работы были начаты в 1994 году, с тех пор масштабы и разнообразие геологоразведочных и производственных работ быстро расширились.

Разнообразие операций BP Caspian и тот факт, что они проводятся в трех странах (Азербайджане, Грузии и Турции), привели к определенной степени сложности законодательства. BP Caspian работает в рамках ряда соглашений между операционными консорциумами под руководством BP и правительствами принимающих стран. Эти соглашения, в том числе Соглашения о разделе продукции (СРП), соглашения с правительством принимающей страны (HGA) и межправительственные соглашения (IGA), устанавливают многие стандарты, по которым оцениваются показатели охраны труда, техники безопасности и окружающей среды (HSSE) в BP Caspian. .Сложный характер этих нормативных требований является ключевым фактором для системы управления ОЗТОС, ориентированной на соблюдение требований BP Caspian.

В этом документе описывается разработка и внедрение Системы управления ОТ, ПБ и ООС компании BP Caspian и дается дополнительная информация по трем ключевым направлениям, а именно:

Юридические и другие требования;

Документация; и

Аудит.

Далее представлен прогресс в направлении безопасных и экологически чистых операций в результате применения этих элементов системы управления.

Введение

BP Caspian является оператором ряда крупных проектов в азербайджанском секторе Каспийского и Закавказского региона и отвечает за инвестиции, разработку и реализацию проектов от имени различных партнерств по проектам в соответствии с согласованным руководством. рамки.

BP Caspian представлена ​​в Азербайджане с 1992 года и быстро стала его ведущим международным инвестором и оператором. Геологоразведочные работы были начаты в 1994 году, с тех пор масштабы и разнообразие геологоразведочных и производственных работ быстро расширились.В настоящее время BP Caspian эксплуатирует следующие активы и объекты (см. Рисунок 1):

• Шесть морских объектов на месторождениях Азери, Чираг, Гюнешли (АЧГ) и газовом месторождении Шах Дениз (ШД).

• Крупный перерабатывающий центр, Сангачальский терминал, где все углеводороды с морского побережья Каспия перерабатываются перед экспортом.

• Три нефтепровода от Сангачальского терминала до терминала Супса на грузинском побережье Черного моря (Экспортный трубопровод западного маршрута (WREP)), границы с Россией (Экспортный трубопровод Северного маршрута (NREP)) и терминала Джейхан на побережье Средиземного моря Турции (трубопровод Баку-Тбилиси-Джейхан (БТД)).

• Один газопровод от Сангачальского терминала до грузино-турецкой границы (Южнокавказский газопровод (SCP)).

ЗАЙЦЕВ АНДРЕЙ Изобретения, патенты и заявки на патенты

Номер публикации: 20110092490

Abstract: Соединение формулы (I) и его фармацевтически приемлемые соли или сольваты и физиологически гидролизуемые, солюбилизирующие или иммобилизуемые производные, где: Ar представляет собой 5-членное гетероарильное кольцо, где X1 и X2 представляют собой один или два гетероатома или Ar представляет собой 6 -членное ароматическое кольцо, в котором гетероатомы выбраны из S, O, N, Se; Z представляет собой NH, NHCO, NHSO2, N-алкил, Ch3NH, Ch3N-алкил, Ch3, Ch3Ch3, CH2CH, Ch3CONH, SO2 или SO; Y представляет собой N CR3; Каждый из R1, R2, R5, R6, R7, R8 и R9 независимо представляет собой Н или заместитель; R3, если присутствует, выбран из алкила и заместителя, при условии, что, когда Y представляет собой CR3, Ar представляет собой 5-членный гетероцикл, содержащий один или два гетероатома N, и Z представляет собой NH, тогда R3 выбран из C3 + алкила и заместителя. ; R4 выбран из H, алкила и R13, как определено выше, при условии, что, когда R3 отсутствует, R4 выбран из алкила и заместителя; способы их получения, промежуточные соединения и предшественники, следовательно, и их использование в качестве лекарственного средства, а также терапевтический компонент

Тип: Заявление

Зарегистрирован: 26 марта 2009 г.

Дата публикации: 21 апреля 2011 г.

Заявитель: НОТТИНГЕМСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Изобретателей: Шудонг Ван, Шэньхуа Ши, Андрей Зайцев, Питер Мартин Фишер